Estandarización de las técnicas de determinación de antígenos HLA, Crossmatch y anticuerpos específicos Luciana Mas Dra en Bioquímica Lab. Histocompatibilidad.

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1 Estandarización de las técnicas de determinación de antígenos HLA, Crossmatch y anticuerpos específicos Luciana Mas Dra en Bioquímica Lab. Histocompatibilidad. Hospital Privado. Universitario de Córdoba.

2 Determinaciones en la línea de tiempo del tx:
*Tipificación HLA. *Crossmatch vs donante: CDC, CDC/FCXM?? *Tipificación HLA. *Status inmunológico: PRA, SAB?? *Crossmatch vs donante: CDC, FCXM, SAB. 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24… SAB Evaluación pre-trasplante del receptor Evaluación del posible donante Trasplante Fallo del aloinjerto PRA: Panel de Anticuerpos SAB: Single Antigen Bead FCXM: Flow Cytometry Crossmatch

3 Tipificación HLA: Identificar las proteínas HLA para las cuales se pueden formar y unir los anticuerpos. Identificar los missmatches entre donante y receptor – la magnitud del estímulo para el alorreconocimiento.

4 Estandarización: Tipificación Molecular en Operativos de trasplante.
Resolución INCUCAI 406.15 Tipificación Molecular en Operativos de trasplante. Método: SSP (Primers de secuencia específica). Loci: A, B y DR. Trabajar con reactivos aprobados (calidad, identificación variantes actualizadas). Resolución: Mediana Informe: Acorde a equivalente serológico. B*14:02 Por implementar: Incorporación de tipificación de Locus DQ (post-distribución).

5 Tipificación Molecular inscripción lista de espera.
Método: SSP (Primers de secuencia específica). PCR-SSO (Oligonucleótidos específicos de secuencia). Hibridación reversa o Lipa Loci: A, B y DR. Resolución: Mediana Informe: Acorde a equivalente serológico. Luminex: *Según NMDP (National Marrow Donor Program). *Equivalente Serológico SINTRA

6 Nomenclatura: Antígenos y Alelos
Alelo - cambio en al menos un AA Tipificación molecular HLA B*44:02 HLA B*44:03 B44 = equivalente serológico El Ac B44 se une a ambos El Ac B4402 no se unirá a la proteína codificada por B*44:03

7 Locus DQ NO EXISTE equivalente serológico para la cadena DQA.
DQB1*02:01 DQA1*02:01 DQB1*02:02 DQ2 SEROLÓGICO NO EXISTE equivalente serológico para la cadena DQA. Se pueden formar anticuerpos dirigidos contra la cadena DQA. También se pueden formar anticuerpos únicos contra las combinaciones DQA-DQB individuales.

8 Distribución Cadavérica. Estandarización.
Detección de anticuerpos El XM contra donante (CDC), detecta altos títulos de anticuerpos específicos que fijan complemento. Bajos títulos de Acs pueden ser detectados por CF, con un resultado positivo requiriendo sólo la unión del anticuerpo y no la activación de complemento. Distribución Cadavérica. Estandarización. XM por CDC *Separación de células T y B *Tratamiento del suero con DTT (*)Incubación a dos temperaturas, dilución del suero. XM por CF *Separación de células con anticuerpos monoclonales, dilución de suero.

9 Ensayos de fase sólida *El suero del receptor es incubado con antígenos HLA purificados, presentados en una plataforma de fase sólida: perlas (Luminex), placa (ELISA). *Se utiliza una IgG anti-humana conjugada con marca fluorescente para detectar el anticuerpo HLA unido a su antígeno target. *La plataforma Luminex genera un resultado semicuantitativo para cada perla, medido como Intensidad Media de Fluorescencia (MFI), la cual es comparada con la MFI de un control negativo, para determinar la presencia de un anticuerpo. Los anticuerpos anti-HLA pueden ser detectados mediante ELISA, aunque con menor sensibilidad que las plataformas de perlas (Luminex). Ha resultado difícil alinear las mediciones de MFI dentro y entre laboratorios, a pesar del aumento de los reportes de esta métrica en investigaciones publicadas.

10 Detección de Anticuerpos: PRA
El PRA% estima el porcentaje de potenciales donantes para los cuales el receptor tiene anticuerpos anti-HLA y aproxima el riesgo de un XM/ DSA positivos. El PRA por sí solo NO equivale al riesgo de rechazo/riesgo inmunológico. Medición de riesgo en pareja receptor-donante. Métodos: Citometría de Flujo, ELISA y Luminex. Informe: IgG anti Clase I: x% IgG anti Clase II: x%

11 Estandarización: Resolución 406.15 ELISA, LUMINEX
(*) Laboratorio de Histocompatibilidad, Hospital Privado. Valor de Corte aprox: MFI

12 Estandarización: MFI < 1.500 ≥ 1.500 No sensibilizado sensibilizado
Hipersensibilizado 1-69% ≥70% Establecimiento de punto de corte. Definir pacientes sensibilizados e hipersensibilizados (puntaje adicional SINTRA).

13 Intercambios de sueros entre laboratorios:
1° Intercambio. Año 2016. Participaron 6 laboratorios: PRICAI, CEMIC, Htal. Italiano de Bs As, Htal. Garrahan Htal. Durand, Htal. Privado de Córdoba. TODOS LOS LABORATORIOS USARON LUMINEX. 2° Intercambio. Año 2017. Participaron 12 laboratorios. *5 laboratorios utilizaron ELISA (2 tenían PRA estandarizado y 3 en proceso de verificación). *8 laboratorios utilizaron LUMINEX. Resultados: *Todos los pacientes no sensibilizados contra clase I y/o clase II fueron informados como PRA 0% por todos los laboratorios (ELISA y LUMINEX). No falsos positivos. *Todos los pacientes sensibilizados fueron informados como tal por ambas metodologías, por todos los laboratorios. No falsos negativos. *Dependiendo del análisis de cada laboratorio y el valor de corte, hubo mínimas variaciones en el porcentaje de PRA informado.

14 relevantes es difícil de definir.
Detección de Anticuerpos: Especificidades Consideraciones de Interpretación *El análisis de SAB considera las MFI entre otros factores en la determinación de un resultado positivo. *Los laboratorios validan su ensayo de SAB con sueros negativos y positivos conocidos, estableciendo un valor de corte en la detección de anticuerpos, y correlacionando este corte con resultados positivos de FCXM (proceso de estandarización específica de laboratorio, dentro de un programa). *Los cortes de MFI pueden ser modificados en base a los antecedentes del paciente, valores de controles, Loci HLA, tipificación HLA del receptor y consideraciones de grupos CREG o epitopes. El corte estricto de las MFI por encima del cual los anticuerpos son clínicamente relevantes es difícil de definir.

15 SAB: Limitaciones. Métrica NO cuantitativa.
Distinguir unión de anticuerpo de control negativo, sin solapamiento entre las distribuciones de las MFI. Densidad del antígeno disminuida. MFI subestima la cantidad de Ac presente Unión no específica. Alto background (IVIG, inflamación, infección). Sobrestimación de la cantidad de Acs. Sustancias interferentes pueden evitar la detección del anticuerpo de interés. (IgM, drogas, proteínas séricas) Epitopes compartidos entre diferentes perlas pueden diluir la cantidad de Ac unido a una perla individual (bajo MFI en la perla de interés) Konvalinka A, et al. JASN 2015

16 no aceptables: XM virtual
Pre- Trasplante Trasplante Post-Trasplante Identificar Ag no aceptables: XM virtual Terasaki y Ozawa (2004): *Índice de fallo de injerto (Acs por fase sólida): 1 año de tx (6% versus 3%) 2 años de tx (15.1% versus 6.8%) Actualidad: no hay estudio que defina el tiempo óptimo para la búsqueda y caracterización de Acs, como tampoco estrategias de tratamiento. Predecir el resultado de FCXM. Corto tiempo: Distribución preliminar. Decidir si vale la pena enviar un órgano (entre provincias). Cambiar la inmunosupresión si el Tx ocurre antes del Xm actual. Terasaki, Ozawa. AJT 2004; 4:

17 Conclusiones: La tipificación HLA y la detección de anticuerpos son críticos en la medición de riesgo inmunológico. Es necesario el entendimiento de estas herramientas por ambas partes: laboratorio (limitantes, interferentes, valores de corte, etc) y equipo de trasplante (interpretación de los resultados en el contexto de cada paciente). Laboratorio HLA: consulta.