Expresión Diferencial del Genoma en el Desarrollo - II

Presentación del tema: "Expresión Diferencial del Genoma en el Desarrollo - II"— Transcripción de la presentación:

1 Expresión Diferencial del Genoma en el Desarrollo - II
Biol 3019 Biología del Desarrollo Universidad de Puerto Rico-Aguadilla JA Cardé, PhD

2 Objetivos Repasar los conceptos de equivalencia genómica y de expresión diferencial del genoma. Repasar la anatomía de un gen y del mRNA Promotores, enhancers, TF y silencers Explicar los mecanismos de transcripción diferencial Discutir el procesamiento diferencial del mRNA Resumir los mecanismos de controlde expresión genética: transcripcional, traduccional, pos- traduccional; y sus implicaciones en el desarrollo.

3 Mecanismos de Transcripción diferencial
TF: Ya se sabe quienes son, pero no se sabía su rol? ChIP-Seq Technique: Aislar y crosslink la cromatina Cortar el DNA (sonicación/enzimas) Incubar con AB vs la proteína de interés Precipitar complejo AB-Prot- DNA Separar el DNA, PCR y secuenciar Chip Seq Tech – para identificar enhancers con proteinas pegadas a ellos.

4 Mecanismos de Transcripción diferencial
ChIP-Seq, identifica dos tipos de promotores High CpG content promoters Default ON, DNA no metilado  activo; para inactivarlo metilar las histonas En genes de control del desarrollo temprano Regulan la síntesis de TF y otras proteínas reguladoras Low CpG content promotors proteínas características de etapas tardías, células maduras Defaults OFF: DNA metilado  inactivo, hay que demetilar y esto permite modificar las histonas y la RNA pol II entra. Cambian idea de como trabajaban promotores y enhancer en la regulacion No toos los promootres son iguales Difieren en contenido de CpG island, regiones de metilacion o demeticlacion

5 Ejs: estados de cromatina en promotores
HCP –High CpG promoters – Default Activada = DNA no metil/Hist H3K4me3 LCP – Low CpG promotres – Default Inactiva= DNA metilado / Hist H3K25me3 Poised- casi metilado – medio metilado a punto de presente en los HCP mas rapidos para responder a senales Los LCP mas lentos porque lo q regula es la iniciacion HCP vs LCP - Activos, Bivalente, Inactivo DNA. Histonas, Otros

6 Transcripción diferencial: mecanismos Metilación del DNA: ON/OFF switch
Histonas metiladas … y el DNA? En las citosinas del promotor 5 Metil-Cit (5ta base) estabiliza nucleosomas y previene transcripción Presente en 5% de las C (siempre seguidas por G) luego de la replicación Regulación transcripcional en vertebrados Metilación del DNA, promotores Bloquea la unión de TF a enhancers con C metilada Facilita reclutamiento de metilasas y deacetilasas, estabilizando el nuclesoma para evitar transcripción (MeCP2) Cambian idea de como trabajaban promotores y enhancer en la regulacion No todos los promootres son iguale, se creia que todas las secuencias de DNA son identicas Difierene en contenido de CpG island, regiones de metilacion o demeticlacion Sea el mismo gen de globina en RBC no es identico en secuencia que en otra celula Drosophila y nematodos no tienen la 5ta Base

7 Transcripción diferencial: mecanismos Metilación del DNA: ON/OFF switch
Gen de Globina Promotor demetilado en RBC vs otras células Developmentally Regulated Genes En vertebrados metilacion de Citosinas en un promotor correlaciona con inactivacion del gen EN RBC de mamif y ave el gen esta demetilado vs otras celulas Genes regulados durante el desarrollo globina epsilo ves gama globina 6 vs 12 semanas

8 Transcripción diferencial: mecanismos Metilación del DNA: ON/OFF switch
El paso de C a 5MeC se manifiesta o tiene su efecto a distintos niveles: Bioquimico –estructura del DNA e interaccion con proteinas etc Molecular – Cambio en la estructura de la cromatina, localizacion, transcripcion uso del genoma Organismal – Procesos del Desarrollo!

9 Metilación: como bloquea la transcripción?
TF se pueden unirse a enhancers no metilados No pueden unirse a enhancers metilados

10 Metilación: como bloquea la transcripción?
Reclutando proteínas que a su vez alteran el nivel de metilación o de acetilación EJ: MeCP2 – liga las Citosinas metiladas Esta a su vez recluta deacetilasas y metiltransferasas Remueven acetilaciones Sustituyen por metilaciones Reclutan a H1 Metilasa de Citosina Proteina 2 MeCP2

11 Metilación: Patrones heredables: DNMT3DNMT1
DNA CpG | DNMT3 (de novo) DNMT1 (forever) MeCP2 tambien recluta: otras Deacetilasas Metilasas de DNA recluta a DNMT3 esta metila C no metiladas Luego la DNMT1 las replica en el nuevo DNA y asi perpetua el patron Pasa el patron de metilacion a las siguiente generacion

12 3 estados de los promotores
Activado – Reprimido – Intermedio Bivalente, estado Intermedio: permite una respuesta rápida a señales de desarrollo Característico de promotores High CpG (HPC); genes de control Escasamente metilados, RNA pol II y nRNAs presentes incompletos, nucleosomas estado intermedio o bivalente con: H3K4me3, activos H3K27me3, inactiva Paso limitante para HPC es alargamiento de los nRNAs Para los LPC, es iniciación Poised- casi metilado – medio metilado a punto de presente en los HCP mas rapidos para responder a senales Presente en desarrollo temprano Los LCP mas lentos porque lo q regula es la iniciacion

13 RNA Procesamiento Diferencial:
Clave para diferenciación: síntesis de diferentes proteínas en diferentes tipos de células Control en Procariota : transcripción, traducción y postraducción Control en Eucariota: uno mas; procesamiento y transporte Splicing isoforms: proteínas distintas del mismo gen: familia En humanos 90% de los genes lo usan Genoma: 20,000 genes < Proteoma: 20,000 proteínas Recuerdan? TranscripciónProcesamiento  Traslocacion Traduccion Post-traduccional Desarrollo usa todos esos puntos de control Uniendo diferentes grupos de exones, diferentes celulas Pueden hacer diferentes mRNAs y PLT deferentes proteinas, todos del mismo gen - familia Los genes tenen secuencias consenso en los 5’ y 3’ de cada intron Splicing isoforms: different proteins encoded by the same gene Splicseosoma Splicing factors Se producen Genes Cells Proteins C elegans 20,000 959 ~20000 H sapiens 100,000 bil ~100,000

14 Alternative Splicing Variants
Spliceosoma Splicing factos (snRNAs) and proteins Produciendo especificos Splicing factors las celulas difierentes an la habilidad de reconocer una secuencia como un intron La secuencia q puede ser un intron en una celula en otra puede ser un exon!! Los factores en una celula pueden reconocer distintos sitios 5’ o 3 ‘ en los intrones

15 Alternative Splicing Variants
Ejemplos de Alternative Splicing Intron grises Exones colores A – condrocitos vs condroblastos - colageno B – Bcl XL  BclXS C – fibroblas growth factor – ectodermo o mesodermo de apendices D - cordin

16 Bcl-XS vs Bcl-XL: - large Bcl = inhibe apoptosis - short Bcl = induce apoptosis en tumores cual predomina? Spliceosome Factores de splicing - Expresados diferencial-mente snRNA U1 y SF2 en 5’ U2AF en 3’ snRNAU1 y splicing factor (SF2) reconocen el 5’ U2Af decide cual sitio de splicing se escoge en el 3’ Pueden resultar en proteinas funciones bien distintas

17 RNAProcesamiento Diferencial: ER-Drosophila Dscam gene38,000 proteínas
Dscam campeona de alternative splicing con 38,000 proteínas en Drosophila Cromosoma 21 en humanos  tecnica? SB Encontrados en axones de neuronas Cuando dendritas del mismo axón se encuentran se repelen Asi se asegura la ramificación de las dendritas Y el q cada neurona adquiera su individualidad Down Syndrome Neurological Disorders Splicing isoforms: different proteins encoded by the same gene 38000 12 posibles secuencias secuencias del 4 48 posibles del 6 33 posibles del 9 2 posibles del 17

18 Altenative Splicing: FGF
IIIb vs IIIc Ambos en entre ex 7 y 10 mesenq IIIC: mesodermo epitelio IIIB ectodermo Metilaciones marcan splicing H3K36me3 excluye el B PPTB Fibroblast Growth Factor: depende de dos exones que se excluyen mutuamente: Exones IIIB y el IIIC IIIB – se incluye para dar lugar a mesodermo del apéndice IIIC – se incluye para dar lugar a ectodermo del apéndice The fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) locus that undergoes alternative splicing consists of two mutually exclusive exons, IIIb and IIIc, which are located between the constitutive exons 7 and 10. Mesenchymal stem cells favour the inclusion of exon IIIc and achieve this by repressing splicing of exon IIIb. Nucleosomes present near exon IIIb contain the SET domain-containing 2 (SETD2)-dependent trimethylated Lys36 on histone H3 (H3K36me3) 'mark' and its reader protein MORF-related gene 15 (MRG15). MRG15 also interacts with polypyrimidine tract-binding protein (PTB), a known repressor of exon inclusion, and this may be the mechanism by which the methylated H3K36 mark can influence splicing at this locus. In epithelial cells, FGFR2 expresses exon IIIb but excludes exon IIIc. Epithelial splicing regulatory protein (ESRP) is expressed and stimulates the inclusion of exon IIIb; reduced levels of H3K36me3 present at this exon, possibly as a result of lower SETD2 levels, allow its derepression. The role of dimethylases, such as the proteins of the nuclear receptor SET domain-containing (NSD) family, in this process has yet to be determined but these enzymes could also influence H3K36 methylation here.

19 Splicing enhancers y recognition factors
Splicing enhancer (cis) sequences (SES) Cerca de sitios de splicing Promueven el ensamblaje del spliceosome Recognition factors (trans) proteins Reconocen las SES y reclutan el splicesoma Polypirimidine track binding - proteínas (PPT) reprimen la formación del spliceosoma Tal como hay spliceosome enhancers tambien lo hay silencers

20 Aplicación clínica Mutaciones en splicing sites:
Resultan en proteínas NO funcionales Distrofina: mutación en un “splicing site” causa que se salte el exón Miostatin gene: mutación induce personas mas “fuertes” Su proteína es un regulador negativo de división celular muscular Hipertrofia muscular – si miostatina no está, el músculo se sigue dividiendo hasta mas tarde: músculos mas grandes The myostatin gene in mice (and other animals) inhibits muscle growth and instead promotes deposition of fat.   This gene is thought to have been evolutionarily conserved in order to promote formation of energy stores (fat) and restrict calorie consumption (by muscle) in animals who don’t have a guaranteed source of food.  This makes sense because what animal knows for a fact that it will find something to eat every day? 

21 Hipertrofia Muscular Proteina truncada, NMD falla

22 Myostatin Knockout But, if this gene is knocked out in the laboratory setting or as a naturally occurring mutation (myostatin “knockout” mice), check out what happens: there is tremendous muscle hypertrophy and a significant reduction of body fat.  There’s a reason why this animal model is called “Mighty Mouse”!

23 Control: Nivel traduccional: longevidad diferencial
Longevidad diferencial del mRNA : media vida del mRNA Mientras mas estable mas dura y mas copias de la proteína Longitud del poli A, secuencias en el 3’UTR para mayor longevidad Estabilización de ciertos mRNA en ciertos momentos en ciertas células mRNA caseína : 1.1 hr en tejido mamario vs 28.5 hrs en lactancia (prolactina) Para probar las 3’UTR se cambian de mRNAs que duran mucho por las de los q duran poco y asi se demuestra mRNA de Caseina en presencia de PRL dura mucho mas que cuando no esta PRL HuD – grupo de proteinas que estabiliza dos grupos de RNAS Proteinas que detienen division celular en neuronas Proteinas que inician diferenciacion neuronal

24 Control: Nivel traduccional: Inhibición selectiva de mRNAs
Ovocito: fabrica y almacena los mRNAs que se usarán solamente luego de fecundación. Se mantienen en estado durmiente hasta que llegue la señal: cambo de polaridad / iones (Ca2+) Ej de mRNAs en el huevo: histonas, actina/tubulina, ciclinas Drosophila: bicoid, caudal, nanos (homeobox) Regulación traduccional “negativa”: inhibidores Regulaciona negativa porq por default los mRNA del huevo deben estar disponibles Cualquier cosa q se haga es para apagarlos Ovocito fabrica y almancena mRNAs que se usaran Luego de fecundacion

25 Control: Nivel traduccional: Inhibición selectiva de mRNAs
5’Cap, 3’ Poly A ; si no están no traducción Circularización de mRNA - 5’ cerca de 3’ eIF4E + eiF4A (helic) eiF4G (scaf) poliABP Maskin CPEB (3’UTR) (uuuuau) eIF4E Fosforilacion de CP y Maskin activa Maskin circularisa mRNA para apagarlos Citoplasmic poly a element binding prot = CPEB Maskin con eIF4E evita entrada de 4G lo que gatillaria traduccion la llegada del ribosoma Final de mieiosis kinasa activa a CPEB, este se une a CPSF y esto activa poliadenilacion PABP se une al poly a y lo protégé PABP interactua con 4G y este saca a Masing

26 Control: Nivel traduccional: Inhibición selectiva de mRNAs
Ovocito de Drosphila – Bicoid Puede ser TF activador –hunchbak Puedes se TF inhibidor - caudal Bicoid: -Reconoce un BRE en 3’UTR del mRNA de caudal -Liga a d4EHP -Previene unión de eIF4E -Sin este eIF4G no se puede pegar e iniciar la traducción Segun el area del huevo de Drosophila anterior posterior Caudal es imp para el abdomen PLT no se puede expresar en la parte anterior del huevo Bicoid a su vez es expresado en abundancia en la parte anterior Pero no en la posterior

27 Control: Nivel traduccional - Tienen favoritismos los ribosomas. NO
Control: Nivel traduccional - Tienen favoritismos los ribosomas? NO! - a favor: mRNAs de Euc son traducidos por ribosomas de Proc - sistema reticuloendotelial: traducción por excelencia SI: Selectividad ribosomal – Ribosomas tienen proteinas distintas dependiendo del tejido Observación de un gen que causaba deformidades en esqueleto axial Encuentran la mutación NO en el gen sino en Rpl38 Traducción Diferencial por Rpl38 Sistema de ribosomas de RBC inmaduros traducen cualquier RNA Rpf mutada o deficiente, el ribosoma sigue traduciendo algunos Pero los Ribosomas en los precursores de esqueleto y de las vertebrass no los puede traducir Hox PLT

28 Control: Nivel traduccional
Rpl 38 – mutada podía traducir muchos mRNAs No podia traducir los mRNAs para los genes Hox Proteína 38 del ribosoma en las somitas, controla expresion de Hox Especifican el tipo de vértebra a lo largo de la columna Deficiencia de Rpl38 causa que las celulas de las vertebras inician traduccion es los Hox PLT  deformidad vertebral Rpf mutada o deficiente, el ribosoma sigue traduciendo algunos Pero los Ribosomas en los precursores de esqueleto y de las vertebrass no los puede traducir Hox PLT

29 Control: Nivel traduccional puede el RNA, como las proteinas unirse a un acido nucleico y bloquearlo? SI microRNAs – forma eficiente y específica de regular la traducción de un mRNA Pequeños, complementarios a mRNA o parte de el Antisense RNA, primera vez en C. elegans Gen lin-4  produce un RNA de 21 ncltd que se pega a varios puntos de un 3’UTR del mRNA de lin 14 Lin 14 El precursor tiene varios repeats, cada uno forma un loop Estos loops son procesados por Drosha y Dicer (RNAsas Estas lo hacen SS RNA

30 Control: Nivel traduccional puede el RNA como las proteinas unirse a un acido nucleico y bloquearlo? SI lin14 usado en larva temprana, luego inactivado, no es necesario lin 4 inactiva la sintesis de LIN-14 miRNAs – sobre 1000 en humanos, regulan 50% de nuestros genes estructurales miRNA: ~ 22 ncltds, lejos o en intrones de los genes Se fabrica a partir de precursores mas gdes El precursor tiene varios repeats, cada uno forma un loop Estos loops son procesados por Drosha y Dicer (RNAsas Estas lo hacen SS RNA

31 Control: Nivel traduccional miRNAs
Conservado El precursor tiene varios repeats, cada uno forma un loop Estos loops son procesados por Drosha y Dicer (RNAsas) Estas lo hacen SS RNA Empacado en RISC- Argonauta Se unen al 3’UTR - Inhiben traducción - Perfect Conservado desde invertebrados a vertebrados sugiere un mecanismo de regulacion Importante pero ignorado por mucho tiempo RiSC 0 RNA induced silencing complex

32 Prim-DroshaPrem-DicermicroAgo
Pri – several llops hairpin procesado por Drosha en individuales Pre- en el citoplasma elimina los loops y actua como helicasa La parte lineal empacada en RISC Se pega en 3’UTR. Dependiente de la complementaridad Empacado en RISC Argonauta Se unen al 3’UTR - Inhiben traduccion - Perfect

33 microRNAs miR1- controla el balance entre crecimiento ventricular y diferenciación miR181 – esencial para la determinación de células progenitoras en celulas B miR430 – operación limpieza de mRNAs maternales el ovocito una vez traducidos (zebra fish), de los primeros en ser expresados en el embrión Fine tuning de Nodal: determinacion de ectodermo/endodermo Son de 22 ncltds, pero con region “seed” de 5ncltd en el 5’ mRNA con 3’UTR mutado y micro RNA no lo reconoce? Texel sheep: myostatin – error de splicing  miostatina G A en 3’UTR, mir1 y mir 206, degradan el mRNA del miostatina Mecanismos de Inhibicion del RISC - - AGO – se pega en el 5 Guanosina y previene al ribosoma de entrar - Recluta endonucleasas degradan el mMRNA

34 Control de expresión de RNA: localización citoplásmica
Se regula el timing y la localizacion de la expresión 3’UTR – represión selectiva y localización selectiva 3 mecanismos de localización Difusion y anclaje por proteinas activadoras (nanos) Proteccion por localizacion (hsp83) Libre difusion como nanos pero no es degradada en unas zonas especificas (polo posterior) Transporte activo (mecanismo mas usado) Proteinas motoras ligan el 3’UTR y lo transportan Son ATPAsas (Dineina y kinesina, osar y bicoid)

35 Protección Localizada
Difusión y anclaje por proteinas activadoras (nanos); se difunde se concentran en el polo posterior Protección Localizada Hsp38 – se difunde, se degradas excepto polo posterior Transporte activo por el citoesqueleto 3’UTR anclados a motores celulares Dineina Kinesina Capitulo 3 – Interaccion celular

36 Regulación Postraduccional
Digestion enzimatica – zimogenos/insulina Compartamentalizacion – mitocondria, lisosomas, nucleo, golgi Dimerizacion, polimerizacion Hgb, Tubulina, actina Cofactores Ca2+. Mg+2 Modificaciones covalentes Fosforilacions, Acetilaciones, Metilaciones

37 Resumen Quiz 1 Dineína Maskin y Bicoid DNMT1, DNMT3 Hud, Neuronas
5-Metil-C miRNA 430 / Danio reiro Rpl38 y Hox Chip-Seq RISC-Ago Caseína y PRL Ovocito (n) H3K4me3 vs H3K27me3 Miostatina μRNA Dscam, Drosophila Control A. Transcripcional B. Postranscripcional C. Traduccional D. PostTraduccional

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