Avances moleculares aplicados a la clínica

Presentación del tema: "Avances moleculares aplicados a la clínica"— Transcripción de la presentación:

1 Avances moleculares aplicados a la clínica
Dr. Denis Landaverde Recinos Oncólogo Médico Msc. Genética y Biología Molecular

2 Métodos Diagnóstico Moleculares
PCR RT-QPCR FISH Microarreglos Bioinformática

3 Dogma Central de la Biología Molecular

4 T C A G ADN A G U C ARN Transcripción C1-21

5 Traducción T A C A T C G A T C G ADN A G U C ARNm U A C A U C ARNt
Ribosoma mensajero A G U C ARNm U A 1 C A U 2 Ile C ARNt transfer Met Traducción

6 T A C A T C G A T C G A U G U A G C U A G C A U C U G A
ADN A U G U A G C U A G C ARNm A U 2 C U 3 Asp G A ARNt Met Ile

7 T A C A T C G A T C G A U G U A G C U A G C
ADN A U G U A G C U A G C ARNm Met Ile Asp Proteína

8 T A C A T C G A T C G A U G C A C G U U G A
ADN A U G C A C ARNm G U U G A Degradación Juang RH (2004) BCbasics

9 Versión final del mecanismo genético celular
ADN es reemplazado por el ARN volviéndose el principal material genético ARN permite la biosíntesis protéica ADN 5’ 3’ proceso ARNm ADN ribosoma ARNm proteinas proteinas cap 5’ 3’ cola ARNm maduro Procariota Eucariota Juang RH (2004) BCbasics C1-22

10 PCR

11 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA. Muchas moleculas DNA (molecule sencilla) PCR amplificación

12 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada

13 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T

14 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A

15 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C

16 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G

17 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T

18 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T A

19 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA Primer 1 Extensión de la cadena Cadena original de DNA ¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?

20 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)

21 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)

22 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C) Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa 2 1 Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1 Ahora tenemos dos copias de la molécula original

23 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura Fusión 95°C Hibridización 50-60ºC Extensión de La cadena 75ºC 2do Ciclo 95ºC ºC 75ºC Primer Ciclo Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

24 Hay 7 componentes esenciales en el proceso standard de PCR
ADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores (“primers”) Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) Cationes divalentes Buffer (para mantener el pH) ADN molde (Templado)

25 RT-QPCR

26 Intrones y Exones en Células Eucariotas
ADN promotor intron 3’ 5’ Codón inicio Codón terminacion Transcripción 5’ 3’ ARNm Procesado cap Cola Poly A Empalme Intron Borrado ARNmaduro Al citoplasma En el núcleo Juang RH (2004) BCbasics

27 El ADNc es transcrito en forma reversa del ARNm
ARNm maduro 5’ 3’ Cola poly A Retro Transcripción TTTT 3’ 5’ ARN hidrolisis 3’ 5’ ADN Polimerasa 3’ CCC 5’ 5’ GGG 3’

28 RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa
Para amplificar copias de cDNA de RNA Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de RNA Frecuentemente usada para amplificar genes específicos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa dependendinte de RNA Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA

29 RT-PCR mRNA (sense) Primer Antisense: oligo(dT)o Transcripción reversa
AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ mRNA (sense) Primer Antisense: oligo(dT)o Transcripción reversa GSP1 (sense) GSP (antisense) AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ 1ra cadena cDNA PCR usando GSP+GSP1 GSP1 GSP Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

30 Cariotipo/Citogenetica

31 Anomalía Citogenética de la LMC: el cromosoma Filadelfia
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 [Slide 10] Cytogenetic Abnormality of CML: the Ph Chromosome1-3 The Ph chromosome was first described in 1960 as a shortened chromosome 22 present in myeloid cells from patients with CML. This was the first report of a human cancer associated with a specific genetic abnormality. Ninety-five percent of patients with CML have the Ph chromosome—hence, this chromosome is the hallmark of CML. The Ph chromosome can be detected in bone marrow cells in metaphase by standard cytogenetic techniques. The Ph chromosome is present in all myeloid cell lineages, including erythrocytes, granulocytes, monocytes, and megakaryocytes, as well as some cells of lymphocytic lineage, indicating that malignant transformation to CML originates at the stem cell level. 13 14 15 16 17 18 X Y 19 20 21 22 References Osarogiagbon UR, McGlave PB. Chronic myelogenous leukemia. Curr Opin Hematol ;6: Pasternak G, Hochhaus A, Schultheis B, et al. Chronic myelogenous leukemia: molecular and cellular aspects. J Cancer Res Clin Oncol ;124: Sawyers CL. Chronic myeloid leukemia. N Engl J Med ;340:

32 El Cromosoma Filadelfia y el Gen bcr-abl
9 q+ 9 c-bcr 1 2-11 c-abl Ph (or 22q-) 22 2-11 p210Bcr-Abl bcr 2-11 p185Bcr-Abl bcr-abl Exones Intronas Puntos de fractura CML Puntos de fractura LLA abl [Slide 12] The Ph Chromosome and the bcr-abl Gene1-4 The Ph chromosome is the result of a reciprocal translocation, t(9;22)(q34;q11), between the long arms of chromosomes 9 and 22. A segment of the abl gene (Abelson mouse leukemia proto-oncogene) on chromosome 9q34 coding for a nonreceptor tyrosine kinase is translocated to the bcr gene (breakpoint cluster region) on chromosome 22q11 to form an abnormal hybrid bcr-abl gene. The bcr-abl gene is transcribed into a hybrid messenger RNA; the translation product of this RNA is an abnormal fusion protein tyrosine kinase. The abl gene, which spans exons 2 through 11 on chromosome 9, encodes native tyrosine kinase (145 kDa). Wild-type Abl (or c-abl) kinase has normal signal transduction activity in a nonmalignant cell. During the translocation between chromosomes 9 and 22, the breakpoint in the abl gene fragment usually occurs 5' of exon 2. In contrast, the breakpoint site on the bcr gene may vary (eg, between exons b1 and b2, b3, or b4), resulting in fusion gene products of varying lengths, which in turn code for fusion protein tyrosine kinases of different molecular masses: 185/190 kDa, 210 kDa, and 230 kDa (not shown), all with tyrosine kinase activity. The Bcr portion of the protein interferes with the regulatory component of the Abl kinase activity, resulting in kinase activity that is constitutively activated. The p210Bcr-Abl fusion protein tyrosine kinase is expressed primarily in CML, the p190Bcr-Abl primarily in Ph+ ALL, and the p230Bcr-Abl in a subset of patients with CML. Proteína de fusión con actividad tirosin kinasa Translocación (9;22) Estructura del gen bcr-abl Pasternak G, et al. J Cancer Res Clin Oncol ;124: Melo JV. Blood ;88: References Pasternak G, Hochhaus A, Schultheis B, et al. Chronic myelogenous leukemia: molecular and cellular aspects. J Cancer Res Clin Oncol ;124: Sawyers CL. Chronic myeloid leukemia. N Engl J Med ;340: Faderl S, Talpaz M, Estrov Z, et al. The biology of chronic myeloid leukemia. N Engl J Med ;341: Melo JV. The diversity of BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype. Blood ;88:

33 Fluorescence in situ Hybridization

34 Fluorescence in situ Hybridization (FISH)
FISH – es un proceso en el cual se pintan las cromosomas o porciones de los mismos con moléculas flourescentes

35 Fluorescence in situ Hybridization (FISH)
Identifica anormalidades cromosómicas. Ayuda para el análisis de aberraciones estructurales, determinación de ploidías, mapeo de genes, etc.

36 Fluorescence in situ Hybridization (FISH)
Usado para identificar la presencia y localización de una resión de AND o ARN con preservación morfológica de preparados de cromosomas en células fijadas o secciones de tejido.

37 FISH Procedimiento Desnaturalizar los cromosomas Hibridación
Marcado Flourescente Examinar las láminas en la oscuridad.

38 FISH Procedimiento

39 Microarreglos

40 Los Microarrays Son dispositivos miniaturizados capaces de realizar un experimento de hibridación múltiple. En la actualidad, existen microarrays que contienen secuencias de todos los genes de un organismo. Se emplean para estudiar si existen genes comunes entre muestras, o sobre todo, para estudiar la expresión de genes globalmente. A continuación, veremos una imagen de un microarray.

41 Tamaño de un Microarray
Un microarray contiene miles de puntos, cada uno correspondiente a una secuencia específica para un gen, compuesta de unos 25 nucleótidos. Sin embargo, el tamaño del dispositivo entero es el mismo que el de un portaobjetos normal.

42 Biochip Basado en Hibridizacion
Muestra de ADN ADN complementario hibridizado Biochip Cada mancha contiene ADN conocido Señal aparente Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31

43 A microarray analysis machine

44 An example of red, green and yellow spots.

45 Bioinformática

46 Bioinformática Definición intuitiva
Conjunto de herramientas informáticas que sugieren soluciones a problemas biológicos

47 Bioinformática es la aplicación de los ordenadores y los métodos informáticos en el análisis de datos experimentales y simulación de los sistemas biológicos

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49 Una definición mucho más global es:
Bioinformática es la aplicación del desarrollo de la computación y las matemáticas que permite la administración, análisis y comprensión de datos para resolver preguntas biológicas. (con conexiones a medi-, quimio-, neuro-, etc. informática). Modificado de: Center for Research on Innovation and Competition (Harvey & Mc. Meekin, 2002).

50 Bases de datos Existen bases de datos primarias, que contienen información directa de la secuencia, estructura o patrón de expresión de ADN o proteína, y secundarias, que contienen datos e hipótesis derivados del análisis de las bases de datos primarias, como mutaciones, relaciones evolutivas, agrupación por familias o funciones, implicación en enfermedades, etc.

51 De nucleótidos La colaboración de las tres bases de datos más importantes hace posible acceder a casi toda la información de secuencias de ADN desde cualquiera de sus tres sedes: EMBL-BANK en el Instituto europeo de Bioinformática (EBI) Enlace externo: EMBL-BANK DNA Data Bank of Japan (DDBJ) en el Centro de Información Biológica (CIB) Enlace externo: DDBJ GenBank en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Enlace externo: GenBank Entrez Nucleotide Si bien son mantenidas por distintos organismos en distintos paises, existe una coordinación entre las distintas bases. Una secuencia enviada a cualquiera de las bases se verá reflejada en las otras dos en aproximadamente una semana, ya que esa es la frecuencia de actualización entre las distintas bases genéticas. Por este motivo es indistinto que base se use para enviar nuevas secuencias, aunque normalmente los europeos utilizan EMBL-BANK y los americanos GenBank.

52 De proteínas Bases de datos de secuencias de aminoácidos.
Swissprot contiene secuencias anotadas o comentadas, es decir, cada secuencia ha sido revisada, documentada y enlazada a otras bases de datos. Enlace externo: Swissprot en el EBI, Swissprot en Expasy TrEMBL por Translation of EMBL Nucleotide Sequence Database incluye la traducción de todas las secuencias codificantes derivadas del (EMBL-BANK) y que todavía no han podido ser anotadas en Swissprot. Enlace externo: TrEMBL PIR por Protein Information Resource está dividida en cuatro sub-bases que tienen un nivel de anotación decreciente. Enlace externo: PIR ENZYME enlaza la clasificación de actividades enyimáticas completa a las secuencias de Swissprot. Enlace externo: ENZYME PROSITE contiene información sobre la estructura secundaria de proteínas, familias, dominios, etc. Enlace externo: PROSITE INTERPRO integra la información de diversas bases de datos de estructura secundaria como PROSITE, proporcionando enlaces a otras bases de datos e información más extensa. Enlace externo: INTERPRO PDB por Protein Data Bank es la base de datos de estructura terciaria 3-D de proteínas que han sido cristalizadas. Enlace externo: PDB

53 ADA COX-2 FKBP XO

54 Wormbase es el portal del genoma de gusano C. elegans.
De genomas Ensembl integra genomas eucariotas grandes, por el momemto contiene genoma humano, ratón, rata, fugu, zebrafish, mosquito, Drosophila, C. elegans, y C. briggsae. Enlace externo: Ensembl Genomes server y TIGR son portales con información o enlaces de todos los genomas secuenciados por el momento, desde virus a humanos. Enlace externo: Genome Server Enlace externo: TIGR Wormbase es el portal del genoma de gusano C. elegans. Enlace externo: Wormbase Flybase es el portal de la mosca del vinagre Drosophila melanogaster. Enlace externo: Flybase

55 Consorcio Público FEBRUARY 2001: Celera Genomics NOVIEMBRE 2001 : Ohio State University

56 Identificación genes Comparación de secuencias Predicción funcional, 3D Mecánica clásica Dinámica Molecular Docking Secuencia DNA Secuencia Proteína Reconocimiento Molecular Estructura 3D

57 Para recordar La bioinformática “sugiere” soluciones. La comprobación experimental es necesaria. La bioinformática puede “ahorrar trabajo”, comprobando teorías in silico La bioinformática permite hacer experimentos imposibles.

58 Aplicación en Oncología
PCR: p53, cmyc, PTEN, QPCR: LMC, LLA Secuenciación: búsqueda de mutaciones Genes BRCA1 y BRCA2 FISH: Her2, Myc, EGFR, P53 Microarreglos: Mamaprint aprobado por FDA

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61 Sigamos adelante….. Gracias

62 Bibliografía www.agendia.com
ASCO Educational Book ISSN rd Annual Meeting June 1-5, 2007 Chicago. Molecular Biology of The Cell, Albert et al, Fourth edition Garland Science Molecular and Cellular Biology. Lodish et al. 5th Whfreeman