Revisión de las metodologías actuales para aislar e identificar Campylobacter spp. de los alimentos Ing. Yurisbel Crespo Suárez.

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1 Revisión de las metodologías actuales para aislar e identificar Campylobacter spp. de los alimentos Ing. Yurisbel Crespo Suárez

2 La campilobacteriosis es una enfermedad transmitida por los alimentos ( la tercera transmitida). Esta relacionado con el síndrome típico diarreico y el síndrome de Guillain-Barre. Aunque existen mas de 20 Campylobacter spp., las mas comunes son Campylobacter jejuni y Campilobacter coli. La leche cruda se identifica como el principal vehículo de transición de campilobacteriosis. Vehículo de transmisión: INTRODUCCIÓN

3 Los protocolos para el aislamiento de Campylobacter de los alimentos fueron adaptadas a microbiología clínica y metodologías para el aislamiento de Campylobacter de la leche se mantiene sin cambios, sin embargo los de ave de corral son objeto de investigaciones.

4 Aislamiento de Campylobacter de alimentos.  Las cepas de Campilobacter spp. Aislado de seres humanos crecieron en condiciones aeróbicas a 42°C y fueron serológicamente diferentes de las cepas de origen animal.  Las cepas de Campilobacter spp. Aisladas de animales no presentaron crecimiento a 42°C, lo que sugiere que estas cepas fueron de Campylobacter fetus.

5 Condiciones de enriquecimiento para el aislamiento. Se presenta un problema ya que en la etapa de crecimiento es común que otras bacterias crezcan. Se probaron distintos medios líquidos para el aislamiento de Campylobacter de carne de pollo. El protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de Campylobacter spp. de carne de pollo se basa en una proporción de 25g de carne con 225ml de un medio enriquecido. (1:9 tiene resultados similares. Durante el aislamiento a partir de muestras, la presencia de otras bacterias presenta una limitación, por eso esta etapa es importante. Hay varios tipos de caldos para el enriquecimiento que se han desarrollado.

6 Contienen componentes utilizados para generar oxígeno Sustitución del aire por mezcla microaeróbica BOLSITAS FRASCOS Selladas Sistema de evacuación de reemplazo Ambiente microaeróbico.

7 Sustancias bloqueadoras de oxigeno. -Existen varios agentes para la desactivación de oxigeno que se han utilizado para los medios (agar y caldo) para el aislamiento, estos agentes pueden incluir sangre de caballo, de otros animales o hematina alcalina, sales de hierro, norepinefrina, sulfatos ferrosos, sodio metabisulfito, piruvato de sodio y carbón vegetal -Oxyrase ®. Es un sistema enzimático que elimina selectivamente oxigeno de su ambiente circulante.

8 Se realizó un estudio 25 g con 100 ml de Bolton más Oxyrase 25 g de carne con 100 ml de caldo de Bolton suplementado Condiciones aeróbicas Suplementaron con 33mg de cefoperazona Se incubaron a 42°C por 48hr Muestras de carne de pollo n= 131 Nota: Suplemento 5% (v/v) de sangre de caballo lisada. Condiciones microaeróbicas

9 La tasa de aislamiento de Bolton Y Bolton con Oxyrase no fueron significativamente diferentes. Se afirma que medio liquido enriquecido de forma natural produce ambientes microareóbicos adecuados para el crecimiento de Campylobacter spp. Resultados del estudio

10 Medios de placa para Campylobacter  El mas utilizado es el CCDA (desoxicolato -Cefoperazona carbón modificado) ya que ofrece una fácil identificación de Campylobacter spp.  En general no hay diferencia en la tasa de aislamiento entre el CCDA y los medios en base de sangre.  La mayoría de los medios de placa selectiva tienen varios agentes antimicrobianos, como cefoperazona y vancomicina como el principal inhibidor de la flora bacteriana.

11 Filtros de membrana  Son utilizados para aislar Campylobacter spp.  Se coloca en la parte superior de la placa y se quita durante la incubación.  Es recomendable incluir cefoperazona y anfotericina B  Primera técnica de aislamiento  Principal ventaja es que los cultivos de Campylobacter puros se obtiene en 36- 48 h.

12 Identificación de Campylobacter 1. Pruebas de aglutinación en látex Uso de anticuerpos policlonales para detectar proteínas de la membranas de proteínas exteriores, las partículas de látex se recubren con inmunoglobulina y se enlazan contra el antígeno de Campylobacter. Son muy utilizados pero solo para la identificar C. jejuni, C. coli y C, lari.

13 2. Métodos moleculares de identificación  Los métodos moleculares de identificación son rápidos y específicos para la identificación de Campylobacter spp.  Se utiliza el método de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la identificación. Método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento particular de éste es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores, primers o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. Así se obtienen en cuestión de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN

14 -Dada la reacción en cadena (PCR) se utiliza para la identificación de Campylobacter. -Los ensayos multiplex han sido diseñados para detectar la presencia de dos o mas especies en la misma muestra. -Este protocolo de PCR fue capaz de detectar 100% de los 59 trenes de Campylobacter s examinados, que incluían 34 cepas de C. jejuni y 25 cepas de C. coli.

15 Metodologías de detección actuales en los EE.UU.  USDA Servicio de Inspección de Seguridad Alimentaria (FSIS), Oficina de Ciencias de la Salud Pública (OPHS) metodología de detección / coli C. jejuni.  La metodología sugerida por el FSIS se describe en el Laboratorio de Microbiología de Guía (MLG).  El método de detección de Campylobacter actual de alimentos y agua se describe en el capítulo 7 del Manual Analítico Bacteriológico (BAM).

16 -Es posible encontrar a bacterias del genero Campylobácter en todas las especies de aves de corral, la infección de estas suele ser, a través de agua contaminada, alimentos y transmisión horizontal. En el ser humano, la transmisión indirecta es la más importante, debida a alimentos poco cocinados como son las aves (principalmente pollo), la leche y el agua.Campylobácter -En muestras con bajo numero de células, se recomiendo el enriquecimiento durante 48 horas bajo condiciones aerobias para lograr un numero detectable de células -Los medios mas recomendados son Bolton y agua de peptona y la CCDA (desoxicolato - Cefoperazona carbón modificado) Conclusiones

17 -La incubación de la muestra a 42 °C durante el proceso de aislamiento -La confirmación de campylobacter según Servicio de Inspección de Seguridad Alimentaria se basa en la microscopia de contraste de fase y prueba de fijación del látex -Aun no son aceptados por las agencias reguladoras en los EE.UU, los ensayos de ADN son métodos sencillos y rápidos para confirmar Campylobacter he identificar el nivel de especie. -La carne de pollo contaminada requiere mayor tiempo de preparación.