Laboratorio de Gripe y Virus Respiratorios

Presentación del tema: "Laboratorio de Gripe y Virus Respiratorios"— Transcripción de la presentación:

1 Laboratorio de Gripe y Virus Respiratorios
Aspectos virológicos y epidemiológicos de los nuevos virus A(H1N1)v en España INMACULADA CASAS Laboratorio de Gripe y Virus Respiratorios Área de Virología CNM, ISCIII

2 Ecología de los virus de la Gripe A
- Múltiples hospedadores, Aves acuáticas son los reservorios naturales Transmisión desde aves a mamíferos Desarrollo de pandemias humanas por transmisión directa o indirecta desde aves Cerdo es susceptible de infección por virus aviares y porcinos Han existido reagrupamientos genéticos en cerdo Se conocía al cerdo como “vasija mezcladora” de virus

3 Mecanismos de adaptación
de los virus H1N1 estacional 1. DERIVA GENÉTICA “drift” necesidad de actualización anual de las vacunas antigripales A/NewCaledonia/20/99 A/Brisbane/59/2007 7 AA mutados

4 Mecanismos de adaptación de los virus
2. REAGRUPAMIENTO DE GENES DE VIRUS DIFERENTES Cambio antigenico mayor “shift” GRIPE A: POTENCIAL PANDÉMICO A/H5N1 Nuevo virus

5 CAMBIO ANTIGÉNICO MAYOR “GENETIC SHIFT” o REAGRUPAMIENTO
'mixing vessels theory’

6 PANDEMIAS HUMANAS POR GRIPE A
1918 “Gripe Española” H1N1, millon PANDEMIAS HUMANAS POR GRIPE A 1957 “Gripe Asiática” H2N2, 1-2 millon 1977 “Gripe Rusa” H1N1, No pandémica 1968 “Gripe HongKong” H3N2,  Evolución antigénica de los virus 8 cambios del componente vacunal H1 2009-VIRUS EPIDÉMICOS

7

8 Classical sw H1N1 European sw H1N1
Maximum likelihood tree of concatenated genome sequences (54 whole genomes) of European and classical swine H1N1 IAVs. Classical sw H1N1 genetically and antigenically stable viral lineage emerged by transfer of the human 1918 pandemic virus to swine spread to swine in America and other parts of the world, including Europe (1976). European sw H1N1 novel lineage of avian-like H1N1 swine IAV emerged in Europe in 1979 that essentially replaced classical swine IAV is enzootic in swine-producing regions of Western Europe, where it cocirculates with swine IAVs of the H3N2 and H1N2 subtypes

9 Occasionally isolated from humans Limited human-to-human trnsmission
Origin of A(H1N1)v 1998 Contemporary human From 1918 A(H1N1) Occasionally isolated from humans Limited human-to-human trnsmission PB2, PB1, PA NS, NP N1 M July-August 2008? Where? H1

10 Host and lineage origins for the gene segments of the 2009 A(H1N1) virus

11 A1 8 Centros Colaboradores de la OMS 110 Centros Nacionales de Gripe:
St. Jude Children's Memphis MRC Londres Institut Pasteur Paris CSL Melbourne NIID Tokio CDC Atlanta 110 Centros Nacionales de Gripe: Laboratorios de Virología MADRID, VALLADOLID, BARCELONA Laboratorios de Virología de las CCAAs Epidemiología Médicos centinelas: recogida de muestras clínicas

12 MSPS OMS y ECDC ISCIII ALERTA
CIRCUITO DE INFORMACIÓN ANTE DECLARACIÓN DE UNA ALERTA POR GRIPE AVIAR EN HUMANOS ALERTA “CASO SOSPECHOSO HUMANO” según los criterios de OMS Laboratorio de Referencia OMS Laboratorio de Virología Red de Vigilancia de Gripe en las CCAAs Epidemiología Laboratorios de Virología ISCIII MSPS CNE CNM OMS y ECDC

13 Procesamiento de muestras clínicas en el laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (CNM, ISCIII)
Recepción y registro de muestras Procesamiento e inactivación de las muestras Salida de las muestras del laboratorio P3 y reparto a los Servicios y Laboratorios del CNM Diagnóstico Específico de Gripe aviar-Gripe estacional Diferencial con el resto de patógenos

14 RT-nested PCR genérica para detección de gripe A+B+C
Gen NP New SW clas Influenza ABC NP

15 RT-nested PCR genérica para subtipar gripe A
Gen HA1 H1 H1

16 RT-nested PCR genérica para detección de los 16 subtipos de HA Gen HA1
H1N1-A/Baleares/R3205/08 H1N1-A/Baleares/R3210/08 H1N1-A/Aragon/R3207/08 H1N1-A/PaisVasco/R3174/08 H1N1-A/Brisbane/59/2007 H1N1-A/Norway/1630/07 H1N1-A/Taiwan/603/05 H1N1-A/Hawaii/01/07 H1N1-A/Norway/2159/06 H1N1-A/SolomonIslands/3/06 H1N1-A/Singapore/19/06 H1N1-A/Texas/02/07 H1N1-A/New Caledonia/20/99 H1N2-A/Yokohama/22/02 H1N2-A/England/2/02 H1N2-A/New York/217/02 A/swine/Ontario/55383/04 H1N2 H1N1-A/USSR/90/77 H1N2-A/swine/England/690421/95 H1N9-A/NWS-G70c/70 A/swine/Ontario/11112/04 H1N1 H1N2-A/duck/NC/91347/01 A/swine/NorthCarolina/36883/02 H1N2-A/swine/Minneso/55551/00 H1N1-A/swine/Wisconsin/168/97 A/swine/Kansas/00246/04 H1N2 A/swine/Ohio/24366/07 H1N1 A/swine/Ohio/C62006/06 H1N1 A/Swine/Indiana/P12439/00 H1N2 A/Swine/Ohio/891/01 H1N2 A/Swine/Indiana/9K035/99 H1N2 A/swine/Minnesota/00194/03 H1N H1N3-A/duck/New Zealand/160/76 H1N5-A/pintail duck/Alberta/63 H1N6-A/mallard duck/Alberta/42 H1N4-A/teal/Alberta/141/92 H1N1-A/swine/Netherlands/3/80 H1N1-A/swine/Netherlands/609/9 H1N1-A/swine/Belgium/1/98 H1N1-A/swine/Italy/110971/01 H1N1-A/swine/Spain/53207/04 H1N1-A/Switzerland/8808/02 H1N1-A/Aragon/R3218/08 H1N1-A/swine/Spain/50047/03 100 96 99 83 75 38 68 24 27 35 46 82 90 74 85 62 44 54 49 88 57 60 77 56 94 93 52 69 87 51 79 98 70 50 0.1 Human seasonal Classical sw lineage Euroasiatic RT-nested PCR genérica para detección de los 16 subtipos de HA Gen HA1 bp 105 H2O SM 104 103 102 10 1 Generic amplification of each 16 sybtypes HA

17 Primer caso gripe AH1N1v en Europa
Almansa (Castilla La Mancha, Spain): GP1-GP2 Detección + secuenciación del fragmento amplificado + análisis de la seq Influenza ABC NP H1 H3 H5 Inf A subtyping Multiplex RESP Multiplex BRQ

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19 Otros virus Gripales encontrados
Inicio del brote: Casos estudiados y confirmados en el Centro Nacional de Gripe (CNM, ISCIII) Semana Fechas Casos Estudio Casos Positivos Otros virus Gripales encontrados 17 26 Abril- 2-Mayo 196 80 10 FluB; 3 FluA H1N1; 1 FluA H3N2 18 3-Mayo- 9 Mayo 70 29 3 FluB; 1 AH1N1 19 10 Mayo- 16 Mayo 13 3 3 FluB 20 17 Mayo- 23 Mayo 47 26 1 FluB; 1 FluA H1N1; 1 FluA H3N2 21 24 Mayo- 30 Mayo 81 43 2 FluA H3N2 22 31 Mayo- 6 Junio 154 142 23  7 Junio- 13Junio 183 152 TOTAL 744 375 17 FluB; 5 FluAH1N1; 4 FluH3N2 1

20 Sistema de Vigilancia de la gripe en España
Temporada Semana 17 26 Abril- 2-Mayo 20

21 Cronología de los casos según el comienzo
de los síntomas

22 Tasa de incidencia semanal de gripe
y porcentaje de detecciones virales positivas. Temporada Sistemas centinela Junio Julio Ago Sept Oct

23 Tasa de detección viral (%) y número de detecciones
virales centinela. Temporada Nula Esporádica Local Situación Epidémica El umbral ponderado para la temporada (64,34) es el umbral ponderado (media ponderada de las tasas semanales de las últimas seis temporadas gripales ( hasta ), usando como factor de ponderación la población vigilada de cada semana.

24 Pacientes positivos secuenciados: 157 / 365
26 Abril a 5 Junio Pacientes positivos secuenciados: 157 / 365 97 M1+M2 39 NP 81 NS 63 HA1 88 NA

25 Análisis de cada segmento secuenciado A(H1N1)v

26 Linaje de la gripe clásica porcina
Linaje Eurasiático A/Madrid/289/GP578/09 military A/Madrid/378/GP781/09 military A/Madrid/292/GP587/09 military A/Madrid/294/GP593/09 military A/Madrid/340/GP727/09 military A/Madrid/296/GP599/09 military A/Madrid/299/GP608/09 military A/Madrid/385/GP796/09 military A/Madrid/295/GP596/09 military A/Madrid/293/GP590/09 military A/Madrid/290/GP581/09 military A/Madrid/390/GP805/09 military A/Madrid/291/GP584/09 military A/Madrid/360/GP752/09 military A/Madrid/297/GP602/09 military A/Madrid/298/GP605/09 military A/Madrid/381/GP786/09 military A/Madrid/391/GP807/09 military A/Valencia/78/GP155/09 A/Murcia/43/GP78/09 A/Catalua/66/GP145/09 A/Catalua/9/GP25/09 A/Andalucia/126/GP242/09 A/CastillaLaMancha/129/GP248/09 A/CastillaLaMancha/1/GP12/09 A/Valencia/77/GP160/09 A/CastillaLaMancha/95/GP181/09 A/CastillaLaMancha/4/GP7/09 A/Valencia/82/GP158/09 A/Valencia/2/GP3/09 A/Andalucia/117/GP230/09 A/Valencia/264/GP494/09 A/Baleares/265/GP500/09 A/Catalua/69/GP148/09 A/Valencia/79/GP161/09 A/Andalucia/167/GP317/09 A/Madrid/37/GP65/09 A/Andalucia/119/GP234/09 A/Madrid/36/GP62/09 A/Andalucia/100/GP201/09 A/Andalucia/118/GP232/09 A/Andalucia/255/GP490/09 A/Madrid/111/GP216/09 A/Catalua/13/GP29/09 A/Catalua/19/GP35/09 A/Andalucia/130/GP251/09 A/Catalua/8/GP24/09 A/Catalua/121/GP237/09 A/Catalua/123/GP239/09 A/Catalua/15/GP31/09 A/Catalua/68/GP147/09 A/Valencia/73/GP154/09 A/Catalua/25/GP41/09 A/Valencia/72/GP153/09 A/Catalua/122/GP238/09 A/Catalua/120/GP236/09 A/Andalucia/71/GP151/09 A/Catalua/65/GP144/09 A/Catalua/63/GP142/09 A/Madrid/308/GP636/09 A/Madrid/288/GP575/09 A/Madrid/305/GP628/09 A/PaisVasco/5/GP19/09 A/Swine/Indiana/P12439/00 H1N2 A/swine/Kansas/00246/04 H1N2 A/swine/Minnesota/00194/03 H1N2 A/Swine/Ohio/891/01 H1N2 A/Swine/Indiana/9K035/99 H1N2 A/swine/Ohio/24366/07 H1N1 A/swine/Ohio/24366/07(H1N1) A/swine/Ohio/C62006/06 H1N1 A/swine/Ohio/C62006/06(H1N1) A/swine/NorthCarolina/36883/02 H1N1 A/swine/Korea/CAS08/2005(H1N1) A/swine/Shanghai/3/2005(H1N1) A/swine/Shanghai/2/2005(H1N1) A/swine/Shanghai/1/2005(H1N1) A/swine/Maryland/23239/1991(H1N1) A/swine/Memphis/1/1990(H1N1) A/swine/California/T /1991(H1N1) A/swine/Ratchaburi/NIAH550/2003(H1N1) A/swine/Iowa/1/1986(H1N1) A/swine/Kansas/3024/1987(H1N1) A/swine/Ontario/11112/04 H1N1 A/swine/Tennessee/4/1978(H1N1) A/swine/Tennessee/2/1978(H1N1) A/swine/Kyoto/3/1979(H1N1) A/swine/Wisconsin/30954/1976(H1N1) A/swine/Tennessee/19/1976(H1N1) A/swine/Tennessee/107/1977(H1N1) A/swine/Tennessee/109/1977(H1N1) A/swine/Tennessee/9/1978(H1N1) A/swine/Thailand/HF6/2005(H1N1) A/swine/Chonburi/NIAH977/2004(H1N1) A/swine/Tennessee/7/1978(H1N1) A/swine/Ohio/K1207/06(H1N1) A/swine/Ohio/K1130/06(H1N1) A/swine/Ontario/55383/04 H1N2 A/Nyiregyhaza/01/2007(H1N1) A/swine/Tianjin/01/04(H1N1) A/swine/Henan/01/06(H1N1) A/swine/France/WVL8/1992(H1N1) A/swine/Hokkaido/2/1981(H1N1) A/swine/England/WVL7/1992(H1N1) A/swine/Spain/WVL6/1991(H1N1) A/swine/Hungary/19774/2006(H1N1) A/Aragon/Spain/RR3218/2008(H1N1) A/swine/Haseluenne/IDT2617/03(H1N1) A(H1N1)v Linaje de la gripe clásica porcina 100 81 69 93 96 85 74 52 55 99 37 50 31 20 76 57 18 39 44 82 51 94 87 98 48 84 62 46 86 61 54 38 42 29 5 26 14 6 35 0.05 Hemaglutinina H1 63 casos positivos cambio de AA A/California/07/2009 vs Cepas españolas L58I P109S (todas) T216A D291E I338V Virus contienen sustituciones de aa en lugares antigénicos concretos cuando se compara con las cepas H1 estacionales Ensayos antigénicos IHA

27 Neuraminidasa N1 88 casos positivos
Linaje de la gripe clásica porcina H1 humana epidémica Linaje Eurasiático Neuraminidasa N1 88 casos positivos No hay resistencias a oseltamivir H274, E119, N294 cambios de AA A/California/07/2009 vs Cepas españolas S247N N248D V338I S340F No se han encontrado cambios genéticos conocidos que puedan disminuir la sensibilidad a INA

28 Matrix 97 casos positivos
M gen, codifica 2 proteinas: M1 y M2 Determinante del tropismo a un determinado hospedador M2 presenta S31N Resistencia a adamantanos presente en todas las secuencias Marcador molecular del linaje Eurasiático Euroasian sw lineage M cambios de AA A/California/06/2009 vs Cepas españolas Human seasonal M1 T185M S224N V147M Classical sw lineage

29 Todas las cepas españolas
Análisis de cada segmento secuenciado A(H1N1)v Mutaciones pareadas NP T373I CastillaLaMancha/GP369 Andalucia/GP381 Cataluña/GP144 Cataluña/GP145 Valencia/GP154 Andalucia/GP196 Andalucia/GP201 Cataluña/GP224 Andalucia/GP234 Cataluña/GP237 Cataluña/GP236 Andalucia/GP251 Valencia/GP280 Madrid/GP62 PaisVasco/GP20 Valencia/GP4 Garten et al. Science. 22 May 2009 NP NA V100I N248D Madrid/GP523 Andalucia/GP527 Madrid/GP216 Valencia/GP272 Valencia/GP278 NP PA T373I M582L not available at momment NP NA V100I V106I N248D NP NA HA1 NS1 V100I V106I S206T I123V HA1 PA S91P S224P V323I 1 2 3 4 NP NA HA1 NS1 V100I N248D S206T I123V Madrid/GP523 HA S91P Todas las cepas españolas

30 Análisis de cada segmento secuenciado A(H1N1)v
Marcadores moleculares de la adaptación al hospedador 1918 H1H1 Virus H5N1 altamente patogénico Dunham et al. J Virol June 2009 H1N1v Avian swClass swEurop Human 1918/H5N1 PB2 627 E E E E K PB1-F2 12 Truncated Compl NS1 220 Truncated Compl-PDZ 25 N Q N,K,R,W R,W*,L Q 66 E E E K* E E R,G E,G* R,del NS2 26 E E E K* E 49 V V V L* V 52 M M M T* M 70 G S G G* G M1 214 H Q Q H* Q NP 284 A A A V,I* A 384 R R R K* R * A/Aragon/R3218/Spain/08

31 Virus nH1N1 crecido en células MDCK
Servicio de Microscopia Electrónica, CNM, ISCIII

32