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Publicada porAlfonso Arroyo Miguélez Modificado hace 8 años
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ICBM COMPUTATIONAL ANALYSIS OF CELL BEHAVIOUR IN DEVELOPING EMBRYOS 16-28 |04|2007 Miguel Concha / Steffen Härtel Programa de Anatomía y Biología del Desarollo, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile
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- - - - - - - - - - - Javier - - - - - - - - - - - Happy Birthday Herzlichen Glückwunsch zum Geburtstag Feliz Cumpleaños Buon Compleanno Parabens - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
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Muestra Microscopio Confocal (LSM) Imágenes I(x,y,z,c,t) Pretratamiento Segmentación Modelo Tridimensional Reconstrucción Visualización Parametrización Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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Muestra Microscopio Confocal (LSM) Imágenes I(x,y,z,c,t) Pretratamiento Segmentación Modelo Tridimensional Reconstrucción Visualización Parametrización Huygens Professional Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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The observation volume (femtoliter) defined by the Point Spread Function must be considered as a mini-sprectrofluorimeter. 1.You need to consider the Offset I(0) in order to calibrate your signal I(0) 0 ! 2.Never saturate the signal: I I max (255 for 8 bit) ! I(0) > 0 I > I max N(PSF(x, y, z) f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Microscopía | Diffraction limited microscopy Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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2| Microscopía confocal de fluorescencia: - Signal/Noise ratio - Nyquist / Sampling Theorem - Huygens Professional, Scripting Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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2. Microscopía | Noise Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Noise & Fluctuation Statistics Statistical Physics Stochastic Processes Probability Theory Information Theory Literature: eg. Noise Theory and Application to Physics: Philippe Réfrégier, Springer
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PSF: Point Spread Function f: Object Function b: Offset Function I: Image Matrix N: Noise Function - Black Body Irrdiation (Poisson) - Detector Noise (Gauss) 2. Microscopía | Noise function N(PSF(x, y, z) f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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2. Microscopía | Noise function N(PSF(x, y, z) f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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2. Microscopía | PDF | Noise function N(PSF(x, y, z) f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) GaussRayleighGamma ExponentialUniform Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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2. Microscopía | SNR Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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- Undersampling looses structures. - Oversampling waists memory/computation time. The ‘Nyquist /Shannon Theorem‘ or ‘Sampling Theorem‘ for the digital sampling of analogue signals suggests a Nyquist rate NR 2 ? ! Diffraction theory calculates lateral NR ~ 20 pixel/µm(~50 nm/pixel) !... laxial NR ~ (~150 nm/pixel) 2. Microscopía | Nyquist /Shannon / Sampling Theorem Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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2. Microscopía | Backprojected Pinhole Radius Pinhole radius [nm]: Huygens works with the backprojected pinhole radius (r b ): r phys : physicel pinhole diameter (LSM image information) m obj : objective magnification factor (10, 20, 40, 63 or 100X) m sys : fixed internal magnification.) NA : numerical aperture N AiryDisc : units of the airy disc r b = r phys / (m obj * m sys ) r b = 0.61 * * N AiryDisc / NA Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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The observation volume (femtoliter) defined by the Point Spread Function (PSF) must be considered as a mini-sprectrofluorimeter: 1.You need to consider the Offset I(0) in order to calibrate your signal I(0) 0 ! 2.Never saturate the signal: I I max (255 for 8 bit) ! I(0) > 0 I > I max Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Parameters for optimal image adquisition
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From the Nyquist Theorem: The sampling frequency (or sampling distance) is a function of the observation volume (femtoliter) defined by the Point Spread Function (PSF): 3.You need to consider sampling distances in x and y 50 nm and … 4. z 150-300 nm for later deconvolution. xy 50 nm Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Parameters for optimal image adquisition
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PSF: xy ~ 500 nm | z ~ 1500 nm N(PSF(x, y, z) f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Microscopía | Diffraction limited microscopy Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Z X Y X
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H (x i,y j,r): X -> Y -> H (x i,y j,r) · I(x,y) Mean: Simplest Low Pass Simplest High Pass 1 1 1 H =1/9 · 1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 H = -1 8 -1 -1 -1 -1 Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Microscopía | Diffraction limited microscopy
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H (x i,y j,r): X -> Y -> Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Microscopía | Diffraction limited microscopy Z X Y X
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2. Basics of Fluorescence | Jablonski Diagram / E, t Intercombinación 10 -8 s 10 -6 - 1s Transiciones: con radiación Niveles: vibracionales sin radiación | -> calor electrónicos -> transferencia de energía -> radicales... 10 -9 -10 -8 s Fluorescencia 10 -6 - 1s Fosforescencia 10 -15 s Absorción 10 -12 s Conversión interna Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile
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PSF: Point Spread Function f: Object Function b: Offset Function I: Image Matrix N: Noise Function Deconvolución es un problema inverso. Pero, la matrix I no tiene la información suficiente para determinar f en forma no ambigua. - Filtros inversos directos:... no consideran N ! - Filtro de Wiener (lineal, ruido tipo Gauss):... reducen, pero no eliminan N ! - Filtros Iterativos (Tikhonov-Miller, Carrington) - Algoritmo de Richardson-Lucy (Poisson):... finds Maximum Likelihood Solution ! 3. Microscopía | Deconvolución N(PSF(x, y, z) f(x, y, z) + b(x, y, z)) = I(x, y, z) Steffen Härtel | 04.07 | Santiago | Chile Maximum Likelihood Solution (PhD-thesis, van Kempen, 1999)
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Recipies for deconvolution:
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Acceder a uno de los servidores SCIAN ingresando la contraseña correspondiente
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En el escritorio, seleccionar el ícono del programa Huygens Professional
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Seleccionar “O” en el cuadro de la imagen
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En el menú File, seleccionar “Open”
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Seleccionar el archivo a deconvolucionar
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Una vez abierta la imagen, seleccionar “ O” en el cuadro de la imagen
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Abrir la pestaña “Parameters”
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Revisar y aceptar los parámetros utilizados en el experimento
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Para setear los parámetros de deconvolución, abrir la ficha Classic MLE
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Setear los parámetros de deconvolución e iniciar el proceso
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Al finalizar es necesario guardar los datos deconvolucionados
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Para guardar, seleccionar en el menú File las opciones “save as” y “tiff”
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