Determinación in-vitro de cepas de Botrytis cinerea resistentes a benzimidazoles. Muñoz C., Oriolani E., Gomez Talquenca S. Laboratorio de Fitovirología.

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1 Determinación in-vitro de cepas de Botrytis cinerea resistentes a benzimidazoles. Muñoz C., Oriolani E., Gomez Talquenca S. Laboratorio de Fitovirología - EEA Mendoza INTA. San Martín 3853 Lujan de Cuyo (5507), Mendoza, Republica Argentina. Teléfono (0261) 4963020/ 3332. cjavier.munoz@gmail.com INTRODUCCION Botrytis cinera es un fitopatógeno que causa la enfermedad de la podredumbre gris en una gran variedad de plantas. La resistencia a benzamidazoles esta relacionada con mutaciones puntuales en el gen codificante para la  -tubulina, que conducen a la substitución de aminoácidos en las posiciones 198 y 200, esta substitucion conduce a una alteración en el sitio de unión a los compuestos benzamidazolicos generando resistencia a este botrycida. OBJETIVOS 1. Determinar si existe resistencia a Benzamidazoles (Carbendazim) en una población reducida de cepas de B. cinerea aislados de vid. 2. Determinar las mutaciones puntuales responsable esta resistencia (aa 198 - 200). 3. Determinar las concentraciones mínimas de botrycidas inhibitorias del 50 % del crecimiento miceliar, en aislamientos sensibles y resistentes. MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento fúngicos: Se trabajo sobre 10 cultivos monosporicos de B. cinerea aislados de vid sin datos previos sobre su suceptibilidad a fungicidas. PCR del gen  -tubulina: Se diseñaron primers (TUB-F,TUB-R) para la región flanqueante a las mutaciones Glu 198 y Phe 200 del gen  -tub que amplifican un fragmento de 372 bp. El producto de PCR fue secuenciado directamente. Co-PCR: se diseñaron dos primers internos (TUB-WT, TUB-M) los cuales se encuentran en direcciones opuestas para determinar en una sola reacción si una cepa presenta la mutación AxC que conduce a la substitucion GluXAla. Determinacion de la dosis mediana efectiva (EC 50 ): Se trabajo con concentraciones de carbendazim a 0, 1, 2.5, 5, 10 y 20 mg/l en medio APG por triplicado. RESULTADOS Las 10 muestras amplificaron un fragmento del tamaño esperado para el gen de  -Tubulina (372 pb). Las muestras se secuenciaron directamente dando como resultado que 3 de las 10 muestras mostraron un genotipo mutante con subtituciones en la posicion Glu 198 X Ala. En Phe 200 no se encontraron mutaciones. La determinación del EC 50 mostró valores de resistencia de 10- 20  g/ml para los genotipos mutantes y < 1  g/ml para el genotipo wild type. Estos datos son coincidentes con los esperados por co-PCR CONCLUSIONES Estos datos confirman la presencia de cepas de B. cinerea resistentes a botrycidas benzamidazolicos aislados de vid. Los genotipos resistentes mostraron la mutación Glu 198 X Ala y no se obserbo la mutación Phe 200. La reacción co-PCR resulto ser confiable y predijo precisamente la resistencia o la sensibilidad al botrycida. Genotipo ResistenteGenotipo Sensible.. GCG ACC TTC.... CTC TGG AAG.. AlA Thr Phe.. GAG ACC TTC.... CTC TGG AAG.. GlU Thr Phe T G TUB-F TUB-R B- TUBULINA 372 pb CO-PCR Resistente 50 bp Sensible 370 bp 250 bp 150 bp ALELO MUTANTE 252 pb ALELO WILD TYPE 154 pb 198 199 200 FINANCIACION: Este trabajo fue financiado con fondos del proyecto INTA PNFRU 2185. NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN C NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN A NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN B- TUBULINA 372 pb ALELO MUTANTE 252 pb ALELO WILD TYPE 154 pb TUB-WT TUB-M