EFECTO DE LOS FLAVONOIDES SOBRE Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000

Presentación del tema: "EFECTO DE LOS FLAVONOIDES SOBRE Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000"— Transcripción de la presentación:

1 EFECTO DE LOS FLAVONOIDES SOBRE Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000
Gracias… o Gracias. Buenos días a todos, hoy voy a presentar nuestro trabajo del efecto de los flavonoides sobre Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Farias, G.A.1, Vargas, P.1, Rivilla, R.3, Olmedilla, A.2, Gallegos, M.T.1 1 Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos, EEZ(CSIC) 2 Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular de Plantas, EEZ(CSIC) 3 Departamento de Biología Universidad Autónoma de Madrid

2 Pseudomonas syringae pv tomato DC3000
MOTEADO DEL TOMATE Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 Solanum lycopersicum Arabidopsis thaliana El tomate es una de las hortalizas más cultivadas y consumidas del mundo y en España representa la especie hortícola más importante para la agricultura, siendo cultivada fundamentalmente bajo invernadero. En estas condiciones el cultivo del tomate puede verse afectado por una infección bacteriana llamada moteado, causada por Pseudomonas syringae pv. tomato, que produce manchas necróticas en hojas, frutos inmaduros y tallos de la planta. Esta bacteria afecta también a Arabidopsis y representa un importante modelo en fitopatología molecular debido principalmente a que su genoma ha sido completamente secuenciado.

3 SISTEMA DE SECRECIÓN TIPO III
JUDÍA P. syringae pv. tomato HR EFECTORES MEMBRANA PLASMÁTICA BACTERIANA MEMBRANA DEL HOSPEDADOR TOMATE A. thaliana P. syringae pv. tomato COMPATIBLE El determinante esencial de la virulencia de esta bacteria es el sistema de secreción tipo III. Dicho sistema, es necesario para la producción de la respuesta hipersensible en plantas no hospedadoras, así como para la patogénesis en plantas hospedadoras. Los efectores producidos por el sistema de secreción tipo III contribuyen a la virulencia combatiendo las defensas de la planta y provocando la muerte celular asociada con los síntomas característicos de esta enfermedad.

4 (FLAVONOIDES, ANTIBIÓTICOS …)
INFECCIÓN TRANSPORTADOR RND PROTEÍNA DE FUSIÓN PROTEÍNA DE MEMBRANA EXTERNA SUSTRATO (FLAVONOIDES, ANTIBIÓTICOS …) H+ La planta responde activamente al ataque de este patógeno produciendo distintos metabolitos secundarios. Unos de los más importantes son los flavonoides que entre otras funciones actúan como agentes antibacterianos en múltiples dianas celulares. Sin embargo, las bacterias han desarrollado mecanismos para eliminar de forma activa estos compuestos tóxicos mediante transportadores de membrana complejos, también denominados bombas. En Pto existe un transportador capaz de eliminar flavonoides que es el MexAB-OprM, una bomba tripartita de tipo RND (Resistance-Nodulation-Cell Division) constituida por una proteína de membrana externa, una proteína de fusión y el transportador RND. Los genes que codifican estas proteínas son bien conocidos en Pto y están regulados por el represor pmeR. Regulador transcripcional pmeR Proteína de fusión mexA Transportador mexB Proteína de membrana externa oprM

5 MUTANTES EN LA BOMBA MexAB-OprM
Transportador Proteína de fusión Proteína de membrana externa Regulador transcripcional mexA oprM pmeR mexB 9 DÍAS POST INFECCION DC3000 DC3000A DC3000R En nuestro laboratorio disponemos de mutantes de Pto que carecen de los genes de la bomba y que infectan la planta con distintos grados de virulencia. A 9 dpi, la cepa silvestre produce los síntomas característicos de la enfermedad. Sin embargo, si la infección se realiza con el mutante DC3000A, que carece de la bomba, la sintomatología es menor porque este mutante es más sensible a los agentes antibacrerianos producidos por la planta al no poder eliminarlos y su supervivencia es menor. Si la infección se realiza con el mutante DC3000R, que carece del represor de la bomba, los síntomas son más parecidos a los de la cepa silvestre. Stoitsova et al., 2008; Vargas et al., 2011

6 MUTANTES EN LA BOMBA MexAB-OprM
60,00 40,00 20,00 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00 MIC (µg/ml) DC3000 DC3000A Ampicilina Cloranfenicol Gentamicina Bromuro de etidio 20 40 60 80 100 120 140 160 Ampicilina Cloranfenicol Bromuro de etidio DC3000 DC3000R MIC (µg/ml) Además se ha podido comprobar que la resistencia a antibióticos, que son otros sustratos de esta bomba, es menor en los mutantes que carecen de la bomba, mientras que es mayor cuando el gen delecionado es pmeR. Para más detalles sobre el funcionamiento y regulación de esta bomba podéis visitar el póster X de nuestro grupo.

7 ENSAYOS IN VITRO ± DC3000 DC3000A DC3000R MOTILIDAD EXPRESIÓN DEL T3SS
Con objeto de determinar el impacto de los flavonoides en la fisiología de Pto DC3000 se utilizó la floretina como flavonoide modelo ya que es uno de los mejores sustratos de la bomba y efector del regulador transcripcional PmeR. Y analizamos su efecto sobre la motilidad y la expresión del sistema de secreción tipo III, tanto en la cepa silvestre como en los mutantes DC3000A y DC3000R. EXPRESIÓN DEL T3SS

8 (MEDIO PGA CON AGAR AL 0,5%)
MOTILIDAD SWIMMING (MEDIO LB CON AGAR AL 0,3%) SWARMING (MEDIO PGA CON AGAR AL 0,5%) - Ft + Ft - Ft + Ft DC3000 DC3000A Para investigar el efecto de la floretina sobre la motilidad de Pto DC3000 en las superficies semisólidas, hemos evaluado las alteraciones del movimiento tipo swimming en placas de LB con agar al 0,3% y swarming en placas de PGA con agar al 0.5% . En la cepa silvestre la presencia de floretina reduce, tanto el movimiento tipo swimming como swarming. En el mutante DC3000A el efecto de este flavonoide es más drástico, mientras que en el mutante DC3000R, el comportamiento con y sin floretina es similar al de la cepa silvestre, tanto en swimming como swarming. Esta reducción en la motilidad bacteriana nos llevó a pensar que la floretina afectaba a la producción de los flagelos. DC3000R

9 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
TINCIÓN NEGATIVA DE CÉLULAS CULTIVADAS EN MEDIO LÍQUIDO LB - Ft + Ft % DE CÉLULAS FLAGELADAS - + DC3000 DC3000A DC3000R fliC Para estudiar las posibles variaciones en el número de flagelos entre las células tratadas y las no tratadas con floretina, visualizamos las células mediante microscopía electrónica de transmisión tiñéndolas con ácido fosfotúngstico y cuantificamos el número de flagelos por célula. En primer lugar observamos células provenientes cultivos líquidos en LB. Cuando cuantificamos los flagelos en las células de la cepa silvestre observamos que el 42% presentan de 1 a 3 flagelos polares y este porcentaje desciende al 16% en presencia de floretina. En el mutante DC3000A el porcentaje de bacterias flageladas es menor ya en ausencia de floretina y disminuye aún más en su presencia, siendo inferior al 5%. El mutante DC3000R resultó más similar a la cepa silvestre. Observamos, pues, que el flavonoide floretina inhibe la producción de flagelos en células cultivadas en LB.

10 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
TINCIÓN NEGATIVA DE CÉLULAS CULTIVADAS EN MEDIO LÍQUIDO MMF - Ft + Ft - + DC3000 DC3000A DC3000R fliC % DE CÉLULAS FLAGELADAS Cuando observamos células provenientes de cultivos en medio MMF, que es un medio inductor del sistema de secreción tipo III que simula las condiciones del apoplasto de la hoja, no se detectó variación en la morfología de los flagelos. En la cepa silvestre observamos que alrededor del 80% de las células presentan flagelos en ausencia de floretina y este porcentaje decrece un 20% en presencia de floretina. En el mutante DC3000A se observa que, al igual que ocurría en LB, disminuye el número de células flageladas. La presencia de floretina provocó la pérdida de los flagelos, ya que prácticamente todas las células observadas carecían de ellos. En el mutante DC3000R el porcentaje de bacterias con flagelo era menor que en la cepa silvestre pero en este caso no se redujo tanto en presencia de floretina.

11 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
TINCIÓN NEGATIVA DE CÉLULAS SWARMERS - Ft + Ft % DE CÉLULAS FLAGELADAS - + DC3000 DC3000A DC3000R % BACTERIAS CON 3-4 FLAGELOS - + DC3000 DC3000A DC3000R Tras la tinción negativa de células swarmers, observamos que más del 70% de estas, tanto de la cepa silvestre como de los mutantes, poseían flagelos y el efecto de la floretina en este caso no era tan obvio. Ahora bien, al analizar el número de flagelos por célula, pudimos observar que, en este caso, DC3000 presentaba entre 1 y 4 flagelos polares (es decir, más que en medio líquido). Cuantificando más detalladamente se pudo comprobar que en DC3000, de las células flageladas, el 18% portaba 3 o 4 flagelos y esta distribución no cambió significativamente en presencia de floretina. En DC3000A, de las células flageladas, el 14% portaba 3 o 4 flagelos en ausencia de floretina. Sin embargo, la exposición a floretina provocó una disminución sustancial en el número de flagelos por bacteria. En el mutante DC3000R, la abundancia de flagelos resultó diferente a la de la cepa silvestre, ya que en ausencia de floretina alrededor del 22% de las células flageladas portaban 3 o 4 flagelos y, sorprendentemente, en presencia de floretina, este porcentaje aumentaba hasta el 39%. Es decir, la floretina en este caso disminuye el número de flagelos por célula.

12 EFECTO DE LOS FLAVONOIDES SOBRE MOTILIDAD
DC3000 - Ft + Ft Es decir, la floretina en este caso disminuye el número de flagelos por célula. Estos resultados soportan la idea de que la disminución en el número de flagelos por células parece provocar una disminución en la motilidad de Pto, lo que es más obvio en el mutante DC3000A

13 EXPRESIÓN DE fliC - + DC3000 DC3000A 0,5 1,0 1,5 INDUCCIÓN

14 EXPRESIÓN DEL T3SS AUTOAGLUTINACIÓN
Para estudiar el efecto de los flavonoides sobre la expresión del sistema de secreción tipo III llevamos a cabo ensayos de autoaglutinación en medio inductor MMF. Este tipo de ensayos se utilizan para evaluar la expresión y el ensamblaje funcional del aparato del sistema de secreción tipo III en Pseudomonas syringae, ya que la presencia de pili Hrp provoca la formación de agregados celulares que se pueden visualizar al microscopio óptico. Taira et al., 1999; Ortiz-Martín et al., 2010

15 AUTOAGLUTINACIÓN -Ft +Ft DC3000 DC3000A hrpL
Cuando llevamos a cabo estos ensayos en medio inductor MMF observamos que las bacterias de la cepa silvestre formaban grandes agregados. En presencia de floretina, estos agregados eran menos numerosos, más pequeños y menos densos. En el mutante DC3000A los agregados celulares eran de menor tamaño y menos abundantes en ausencia de floretina, y desaparecían completamente en presencia de floretina. Como control negativo utilizábamos el mutante hrpL, que no producía agregados, lo que indicaba que efectivamente su formación dependía del sistema de secreción tipo III.

16 EXPRESIÓN DE hrpL 0,00 0,50 1,00 1,50 DC3000 DC3000A hrpL - +
INDUCCIÓN Además se analizaron los niveles de ARN mensajero del factor sigma alternativo hrpL mediante qRT y se observó que estaban incrementados en células de Pto DC3000 incubadas en MMF, en comparación con las células cultivadas en LB, como se había observado previamente. Sin embargo, los niveles de mensajero de hrpL disminuyeron un 70% en la cepa silvestre al añadir floretina (0,15 mM). El efecto inhibidor de la floretina sobre el T3SS se confirmó al analizar la expresión de hrpL en el mutante DC3000A y observar el mismo comportamiento.

17 CONCLUSIONES Los flavonoides disminuyen la motilidad, tanto de tipo swimming como swarming en DC3000. Este efecto es más acusado en DC3000A.  Esta disminución de la motilidad se debe a la reducción en el número de flagelos por célula.  Los flavonoides inhiben la expresión del T3SS, lo que se observa ya a nivel transcripcional en la expresión del factor sigma alternativo hrpL.

18 AGRADECIMIENTOS Paola Vargas Antonia Felipe Adela Olmedilla
Mª Trini Gallegos Isabel Aragón Cayo Ramos Rafael Rivilla Ministerio de Ciencia e Innovación BFU Junta de Andalucía (proyecto de excelencia) P08-CVI-03475 Junta de Andalucía (proyecto de excelencia) P10-CVI-5800

19 GRACIAS