Mapas, geneticos, fisicos, citologicos y de Secuencia;

Presentación del tema: "Mapas, geneticos, fisicos, citologicos y de Secuencia;"— Transcripción de la presentación:

1 Mapas, geneticos, fisicos, citologicos y de Secuencia;
Tipos de marcadores

2 Outline Construcción de mapas genéticos Tipos de marcadores genéticos
Genotecas de DNA Vectores de clonamiento Mapas citológicos FISH - fluorescence in situ hybridization Construcción de mapas físicos Superposición de mapas físicos y genéticos Mapas de secuencia y anotación

3 Mapa genético Mapa físico Mapa Citológico Mapas de Secuencia
Mapa basado en estimados de recombinación entre marcadores (loci) en una población segregante derivada de parentales genéticamente diversos. Requiere polimorfismo genético en loci múltiples para determinar si ha ocurrido recombinación. Mapa físico Basado en el alineamiento físico de fragmentos de ADN de un único genotipo. El orden de los clones esta determinado vía hibridación con marcadores genéticamente cartografiados e identificando clones superpuestos a partir de una genoteca de insertos grandes. Mapa Citológico Basado en la observación visual del largo del cromosoma, posición del centrómero, proporción de los brazos, patrones de tinción para hetero- y eu-cromatina. Puede estar correlacionado con los mapas genéticos y físicos. Mapas de Secuencia Secuencia de nucleótidos a lo largo del cromosoma generalmente representan un único genotipo de una especie.

4 Construyendo mapas genéticos moleculares
Escoger dos parentales genéticamente diversos Cruzarlos y desarrollar una población segregante Familias F2, F3, BC1, Líneas endocriadas recombinantes (RILs) desarrolladas por single seed descent (SSD), dobles haploides (DH), líneas de introgresión retrocruzadas (BILs) Extraer el DNA y evaluar la progenie con marcadores de DNA Determinar la herencia del segmento de DNA en los locus de cada marcador Determinar el orden de los marcadores a lo largo de los cromosomas basados en la frecuencia de recombinación entre pares de marcadores Marcadores que están localizados cerca mostraran menos recombinación que marcadores que están lejos o en cromosomas independientes. Nota: caracteres fenotípicos o bioquímicos pueden ser mapados basados en al co-segregación con marcadores de DNA.

5 Que es un marcador de DNA?
Una manera de determinar la posición en un cromosoma. Los marcadores pueden identificar un nt especifico o pueden representar un segmento de DNA; pueden ser segmentos clonados o simplemente amplificados vía PCR Marcadores de copia simple ocurren en regiones se secuencia única Marcadores de copia múltiple contienen secuencias que están repetidas en el genoma y por lo tanto tienen posiciones múltiples (a pesar que siempre están flanqueadas por DNA de copia simple) Marcadores genéticos que detectan polimorfismos (diferencia) en el DNA entre dos individuos. Diferencias genéticas detectables son un pre-requisito para construir mapas genéticos Los marcadores polimórficos pueden ser evaluados para determinar el origen ancestral de una porción de DNA; pueden ser co-dominantes (distinguir entre heterocigotas y homocigotas ) o entre dominante/recesivo (+/-)

6 Que son los marcadores Los marcadores genéticos son loci polimórficos que nos informan: Sobre el genotipo del individuo que lo porta Sobre el genotipo de un locus vecino Los mas usuales son los marcadores morfológicos los marcadores moleculares Marcadores bioquímicos (acepción genética)

7 Tipos de marcadores (lista no exahustiva)
Marcadores codominantes revelados individualmente RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence ) SSCP (single-stranded DNA conformation polymorphism ) Polimorfismos de numero de unidades de repeticion Microsatelites o SSR (simple sequence repeats) Marcadores dominantes revelados en masa (huellas dactilares genéticas) Polimorfismos de secuencia AFLP (amplified fragment lenght polymorhism)

8 Diferencias a nivel de dianas de restricción
Restriccion Fragment Length Polymorphism: RFLP Las enzimas de restricción, son enzimas que cortan (digieren ) el ADN en sitios específicos llamados de restricción. Estos sitios comprenden un numero par de bases: 4,6,8 y a veces más en general en palíndromos APA I GGG CCC CCC GGG Bam HI GGATCC CCTAGG

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10 Una enzima que tenga un sitio de reconocimiento de 6 bases va a cortar el ADN cada 4096 bases en promedio (46). Un genoma de 109 bases va a producir unos fragmentos de largos variables. La especificidad es tal que el cambio de una sola base es suficiente para evitar el corte. Es esta especificidad que es utilizada para poner en evidencia el polimorfismo: Una presencia o ausencia de un sitio de restricción conlleva a un polimorfismos de largo del fragmento

11 Rebase http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

12 Principio del RFLP - ARNm I II ADNc I II Clonaje marcardo I II I II +
Enz restricción II Enz restricción ADNc I II Clonaje - marcardo I II I II +

13 RFLP y análisis de Southern
cDNA o clones genómicos Puede determinar el numero de copias de una secuencia dada en el genoma. Técnica ampliamente usada para mapeo comparativo ya que requiere solo ~85% de similaridad entre seq para hibridizar con severidad media Usada para tamizar genotecas BAC/YAC RFLP - garden blot Trigo Arroz Avena Cebada

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15 Polimorfismos de secuencia –sitios de restriccion y diferencias en sitios de hibridacion de una sonda arbitraria 2: AFLP AFLP: a new technique for DNA fingerprinting nucleiic acids Research. Vol 23, no 21 P Vos, R Hogers, M Bleeker, M Reijans, T van de Lee, M Hornes, A Frijters, J Pot, J Peleman, and M Kuiper Keygene N.V., Wageningen, The Netherlands

16 AFLP y Transposon Display (TD)
Métodos globales “Whole-genome” basados en la identificación de polimorfismos de largo de secuencia amplificados “amplified fragment-length polymorphisms” . Se usa amplificaciones de PCR selectivas de segmentos genómicos o de cDNA, digeridos /ligados TD usa un primer especifico de la secuencia consenso de un elemento transposable (TE). Ello resulta en amplicones que tienen un extremo anclado en una inserción TE y la otra en un región flanqueante con sitio de restricción definido a 400bp. El poder de la técnica es que genera muchos fragmentos en una sola reacción que puede ser ampliamente explorada para sus polimorfismos. La debilidad es que los marcadores son dom/rec y no están anclados a una posición especifica en el mapa

17 The AFLP technique is based on the amplification of subsets of
genomic restriction fragments using PCR. DNA is cut with restriction enzymes, and double-stranded (ds) adapters are ligated to the ends of the DNA-fragments to generate template DNA for amplification. The sequence of the adapters and the adjacent restriction site serve as primer binding sites for subsequent amplification of the restriction fragments (Fig. 1). Selective nucleotides are included at the 3' ends of the PCR primers, which therefore can only prime DNA synthesis from a subset of the restriction sites. Only restriction fragments in which the nucleotides flanking the restriction site match the selective nucleotides will be amplified (Fig. 1). The restriction fragments for amplification are generated by two restriction enzymes, a rare cutter and a frequent cutter. The AFLP procedure results in predominant amplification of those restriction fragments, which have a rare cutter sequence on one end and a frequent cutter sequence on the other end (this will be explained below, see also Fig. 3). The rationale for using two restriction enzymes is the following. (i) The frequent cutter will generate small DNA fragments, which will amplify well and are in the optimal size range for separation on denaturing gels (sequence gels). (ii) The number of fragments to be amplified is reduced by using the rare cutter, since only the rare cutter/frequent cutter fragments are amplified. This limits the number of selective nucleotides needed for selective amplification. (iii) The use of two restriction enzymes makes it possible to label one strand of the ds PCR products, which prevents the occurence of 'doublets' on the gels due to unequal mobility of the two strands of the amnplified fragments. (iv) Using two different restriction enzymes gives the greatest flexibility in 'tuning' the number of fragments to be amplified. (v) Large numbers of different fingerprints can be generated by the various combinations of a low number of primers.

18 AFLP fingerpfints of genomic DNAs of various complexities: X
DNA (panel I), AcNPV DNA (panel II), Acinetobacter DNA (panels Illa and Illb) and yeast DNA (panels IVa and IVb). Letters A, B, C, D and E refer to none, one, two, three and four selective bases in the AFLP primers respectively. The primer combinations used were from left to right: I. EcoRI+0/Msel+O, II. EcoRI+0/MseI+0, IIIa. EcoRI+OIMseI+A, EcoRI+CIMsel+A, EcoRI+C/Mse- I+AT, llb. EcoRI+0/MseI+T, EcoRI+C/Msel+T, EcoRI+C/Msel+TA, IVa. EcoRI+C/Msel+G, EcoRJ+C/MseI+GC, EcoRI+CAIMseI+GC, NVb. EcoRI+Cl MseI+T, EcoRI+C/Msel+TA, EcoRI+CA/MseI+TA. (+0 indicates no selective nucleotides, +A indicates selective nucleotide = A, etc). The molecular weight size range of the fingerprints is nucleotides.

19 Polimorfismos de Unidades de repeticion: SSR- simple sequence repeat
Identify SSR’s computationally, using a BLAST query (see Simple Sequence Identification Tool available at and available genomic or EST sequence If no sequence available, construct enriched or unenriched small-insert clone library; screen it by hybridizing labled oligo (with SSR motif of interest); send positive clones for sequencing design primers in single copy regions flanking SSR repeats such that the amplified fragments will be >50bp and <350 bp; look for size polymorphism on PAGE gels For multiplexing, design primers with similar Tm and a range of expected amplicon sizes so have non-overlapping groups of markers on gel AGAGAGAGAGAGAGAG

20 Polimorfismos de Unidades de repeticion: SSR- simple sequence repeat

21 SSRs marcadores altamente polimórficos, multialelicos, copia única, co-dominantes
AGAGAGAGAGAGAGAG SSR - segregación en RIL o población DH (tinción plata) Segregación en población F2 Automated diversity fingerprinting

22 SNP- single nucleotide polymorphisms
Son la forma de polimorfismo abundantes y mejor distribuida. Se detectan: Alineamiento de secuencias de genotipos múltiples usando dHPLC (denaturing, high-performance liquid chromatography) donde los amplicones de genotipos diferentes son disociados y re-apareados y luego pasados a través de una columna a una temperatura critica donde las moléculas homo y heteroduplex se disocian en tiempos diferentes usando la enzima CeL1 (que reconoce diferencias de una base en moléculas heteroduplex y corta en AND precisamente el lado 3’ del mismatch) Usando mass-spec que calcula diferencias en el peso molecular de los fragmentos amplificados (medidos en daltons)

23 Ventajas de los diferentes marcadores
RFLP RAPD SSR AFLP TD SNP Alto polimorfismo Bandas promedio Análisis Automático Co-dominante Señalan genes activos Mapeo Comparativo + 1-2 - +/- + 5-15 - +++ 1-15 + +/- - + 30-70 - +++ 30-70 + - + 1-1500 -

24 Como se usan los marcadores?

25 M 29 MARKER (365 bp) (CAPS) The original band weights 365 aprox.
M A B H H S S R H H R R R R H H H H S H H H S H R R R H H R S H S H M The original band weights 365 aprox. In the resistant parent, the digestion with Afl III produces two bands: 191 bp and 174 bp aprox. The susceptible parent PS shows the original band because it doesn’t have any target restriction for Afl III. The polymorphism between parents is very clear. The heterozygote shows both bands. A: resistant Korean accession PI B: “Piel de Sapo” (PS) or T111, susceptible parent H: heterozygote M: pUC Mix, low weight molecular marker

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27 Cartografía básica Usar los datos de segregación para establecer el ligamiento Comparaciones de dos en dos entre todos las posibles combinaciones de marcadores para cada individuo en la población Los marcadores se registran como 1= alelo Maternal; (2= Heterocigoto); 3= alelo Paternal Determinar cuales son los pares mas frecuentemente heredados juntos ( mismo score) usando individuos en la población como repeticiones para probar la asociación Establecer el orden de los marcadores a lo largo del cromosoma, confirmar usando la prueba de tres puntos o análisis de “intervalo” Plant # -> # # # # # # # # # #10 RM RM RM RM red leaf gr gr red gr red gr gr gr gr gr RM RM 40 cM 10 cM Caracter/Marcador RM 20 cM 0 cM

28 Cartografía física Cortar los cromosomas en fragmentos pequeños que puedan ser mantenidos, propagados y caracterizados. Ordenarlos en sus posiciones correspondientes en los cromosomas. Una vez que el mapeo se completa, el siguiente paso es determinar las bases de cada uno de los fragmentos que ha sido ordenado

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30 Enzimas de restricción (Restricción incompleta)

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32 Vectores Vectores Características Talla inserto
Molécula de DNA que se origina de un virus, un plásmido o de la célula de un organismo superior en la que otro fragmento de DNA de un tamaño apropiado puede ser integrado sin que el vector pierda su capacidad de auto-replicación Los vectores introducen DNA en células hospederas, donde el DNA puede ser reproducido en grandes cantidades. Vectores Características Talla inserto Plásmido E.coli- Introducidos por transformación kb (electroporación o heat shock) Fago E.coli- Virus que infecta bacterias kb Introducido por transfección Cósmido E.coli- Plásmido con “cos” sites para kb el packaging en fagos lambda. Introducidos por infección en E. coli

33 Cromosomas Artificiales : para el map-based cloning
Vector Características Talla-inserto BACs: E.coli- Basado en el F factor ocurre natural kb mente. Estable, 1-2 copias por célula TACs Contiene T-DNA (w vir genes) puede ser kb BiBACs: transformado en plantas con Agrobacterium PACs: E.coli- Basado en el genoma del fago-bacteria kb P1 (un virus) YACs: Cel. levadura ( veces mas volumen < 1,000 kb que E. Coli). Usualmente inestables tienen re-arreglos (1 Mb) En experimentos de clonamiento posicional, Nunca crean en un solo clon grande ! YAC’s tienden a rearreglos y deleciones, etc.

34 Requisitos de un Vector
Marcador de selección Resistencia a ampicilina, kanamicina, hygromicina, herbicidas, etc. Permite que solo los clones recombinantes sobrevivan Sitios de clonamiento múltiple (mcs) muchos (únicos) sitios de restricción Los vectores que amplifican en E. coli: Origen de replicación (Ori): requerido por el plásmido para replicarse en la bacteria Control del numero de copias (F factor plasmid): reduce el numero de copias del plásmido en una célula dada para evitar problemas de re-arreglos (quimeras)

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36 Construcción de mapas físicos
Los mapas físicos de construyen con arreglos continuos de clones con insertos grandes (YAC, BAC, PAC, etc) y alineándolos a un mapa de ligamiento genético Se hace el fingerprint (i.e.digestion con HindIII) de las genotecas grandes (10-20X) y los extremos de cada BAC se secuencian El patrón de restricción de los clones se aparea usando un programa que se llama FPC (fingerprint contig) que permite que los clones sean ensamblados en contigs Los Contigs se alinean a los mapas genéticos hibridándolos a marcadores o alineando informaticamente la secuencia de los marcadores a la secuencia de los BAC-end o YAC, PACS ETC.

37 Fig. 2: Chen et al. (2002) The Plant Cell 14:537-545
Esto es un contig

38 Fig. 1: Chen et al. (2002) The Plant Cell 14:537-545
Mapa fisico:genetico. BACs anclados en rojo, huecos en negro, centromero en verde. Un pequeño numero de marcadores es suficiente para anclar los contigs al mapa genetico. Los gaps remanentes usualmente consisten en repeticiones que son dificiles de clonar o secuenciar.

39 Mapa fisico MNSV

40 A physical map covering the nsv locus that confers resistance to Melon necrotic spot virus in melon (Cucumis melo L.). Morales, Orjeda, Nieto TAG

41 Mapas citologicos Citología y Cariotipos
Los cromosomas son identificados visualmente e identificados por: Largo físico Posición del centrómero Razón del largo de brazos (corto:largo) Patrones de tinción que detectan áreas de heterocromatina y eucromatina Tinción al Acetocarmín Tinción DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole se une preferentemente a regiones ricas en AT) Hibridación de marcadores específicos mapados FISH (Fluorescent in situ hybridization)

42 Ideogram of rice pachytene chromosomes Cheng et al
Ideogram of rice pachytene chromosomes Cheng et al. (2001) Genome Research 11: Las regiones DAPI-brillantes detectan heterocromatina. En Arabidopsis, casi toda la heterocromatina teñida con DAPI es centromerica, mientras que en arroz es pericentrica, asi como telomerica e intersticial. Fig. 3 (no legend) Basada en observaciones de 50 células en paquiteno. Círculos = DAPI brillante Círculos abiertos = centrómeros Círculos sombreados = regiones DAPI-brillantes en indica pero no en japónica Línea punteada chr 9 = sección rDNA Largo relativo de cada K y brazo medido en um

43 FISH mapping en el K 10 Fig. 4 Fig. 3 Fig. 4
Los cromosomas en paquiteno son 10X mas largos que cromosomas somáticos en metafase por lo que proveen resolución mas alta para los mapas citológicos. Los clones BAC separados por ~100 kb pueden ser resueltos en k en paquiteno y dar un estimado de la distancia fisica:genetica y su relación con regiones heterocromaticas. Fig. 3 Fig. 4 Fig. 4 Cheng et al. (2001) Genetics 157:

44 High-Resolution Pachytene Chromosome Mapping of Bacterial Artificial Chromosomes Anchored by Genetic Markers Reveals the Centromere Location and the Distribution of Genetic Recombination Along Chromosome 10 of Rice Zhukuan Cheng, et al 2001 Genetics Physical mapping of the most distal BAC clones 46L02 and 56G17 in an indica rice variety Zhongxian (A) Diagrams of chromosome 10 from japonica and indica rice. The rDNA locus and an Os48 locus are located at the distal ends of the chromosome 10 of indica rice. These two loci are not found on chromosome 10 of japonica rice. The relative sizes of the colored bars do not correspond to the physical sizes of the DNA loci. (B) A pachytene chromosome 10 of Zhongxian 3037 hybridized to BAC 46L02 (red) and pTa71 (green, the nucleolus organizer region). (C) Fiber-FISH images from hybridization of DNA fibers of Zhongxian 3037 to probes 46L02 (red) and pTa71 (green). Only part of the signal (toward the gap) derived from pTa71 is shown in the images, whereas the signals from 46L02 are complete. (D) Pachytene chromosomes of Zhongxian 3037 hybridized to BAC 56G17 (red) and pOs48 (green). (E) Fiber-FISH images from hybridization of DNA fibers of Zhongxian 3037 to probes 46L02 (red) and pOs48 (green). Only part of the signal (toward the gap) derived from pOs48 is shown in the images, whereas the signals from 56G17 are complete.

45 Chromosomal arm-specific bacterial artificial chromosome (BAC) markers and rice chromosome identification Zhukuan Cheng et al. Genome Res. 2001; 11: Chromosomal arm-specific bacterial artificial chromosome (BAC) markers and rice chromosome identification. (A) The morphology and DAPI-staining patterns of the 12 rice pachytene bivalents were identified by hybridization to the 12 short-arm-specific BAC clones (green arrowheads; clone names are listed in Table 1), centromere-specific probe pRCS2 (yellow arrowheads), and the 12 long-arm-specific BAC clones (red arrowheads). The three probes on each pachytene bivalent were sequentially probed on the same pachytene cells. Grey-scale images of the FISH signals were pseudocolored as green, yellow, and red, respectively, and merged with the chromosomal image. (B) A somatic metaphase cell of rice primary trisomic 11 (2n = 24 +  11S·11L) probed with BAC a0071H11 that is specific to the long arm of rice chromosome 11. FISH signals are observed on three chromosomes. Bar, 5 µm. (C) Interphase nuclei from root tip cells of rice primary trisomic 11 hybridized to BAC a0071H11. Three hybridization spots are observed in each nucleus, indicating three copies of chromosome 11 in this plant. Bar, 10 µm. (D) A somatic metaphase cell of a variant derived from a primary trisomic 11 plant probed with the 11S-specific BAC a0040B10 (green signals), 11L-specific BAC a0071H11 (yellow signals), and centromere-specific clone pRCS2 (red signals). This plant contains one normal chromosome 11 (11S·11L), one telocentric chromosome derived from the long arm of 11 (11L·), and one isochromosome derived from the short arm of 11 (11S·11S). Image process is the same as that in Fig. 1A. Bar, 5 µm.

46 Mapas basados en secuencia
Una vez que los genomas han sido secuenciados el trabajo es anotar las caracteristicas del genoma usando metodos computacionales y experimentales. Los mapas de secuencias contienen huecos (gaps) en los centromeros, rDNA y otras regiones repetidas. Arabidopsis: 25, 498 genes predecidos 69% de los genes pudo ser clasificado de acuerdo a la similaridad de la secuencias con proteinas de funcion conocida en otros organismos, mientras que 30% permanecen funcionalmente no clasificadas. 9% de los genes estan siendo caracterizados experimentalmente 14% de los genes asignados a los cloroplastos Se observa una redundancia pronunciada que incluye duplicaciones segmentales y arreglos en tandem

47 Organizacion del genoma
24 segmentos duplicados de 100kb o mas, que comprenden 58% del genoma de Arabidopsis apoyan la hipotesis de eventos multiples de duplicacion y origen poliploide ancestral Muchas inversiones locales, perdida/lganancia de genes en las regiones duplicadas 17% de los genes de Arabidopsis estan dispuestos en tandem Se sugiere redundancia funcional o una sutil diferenciacion de patrones de expresion entre genes duplicados 7% de los exones poseen polimorfismos (SNPs & indels) sitios de splicing alterados en 25% de los genes predichos. Los Transposones componen 10% del genoma (20% de zonas intergenicas del DNA). Retrotransposones ocurren primariamente en los centromeros y estan correlacionados con baja tasa de recombinacion.

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