Boris L. Rodríguez González, Ph. D. Departamento de Genética, CNIC. Obtención, Caracterización y Evaluación de cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae.

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1 Boris L. Rodríguez González, Ph. D. Departamento de Genética, CNIC. Obtención, Caracterización y Evaluación de cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae

2 4. Enfermedad diarrea + vómitos acidosis dolores musculares choque hipovolémico El cólera 3. Coloniza (produce enterotoxina) 1. Vía entrada 5. Excreción (  1 L/día) 2. Vence inm. natural

3 1. Vacuna contra el cólera El Tor inexistente. 2. Protección en convalecientes  3 años. 3. Toxina colérica requisito para el cólera gravis. 4. Inmunidad antibacteriana protectora. 5. Inmunidad antitoxina superflua. 6. Desconocimiento de la combinación de Ag Protectores. 7. Vacunas muertas: EP = 60% (exc niños), 2 - 3 dosis. Racionalidad vacunas vivas de cólera

4 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V. cholerae DE GENERACIÓN 1 Deleción del profago CTX Φ Cepas patógenas de V. cholerae V cholerae C7258 El Tor Ogawa V cholerae C6706 El Tor Inaba Genes de CTX Φ E.coli SM10 pir (donante 1) Conjugación Pases y Selección Estrategia

5 Remoción de CTX . Eventos moleculares C6706 C7258 C67 8 C67 4 C72 8 C67 1 C67 3 C72 3 4 13 4 17 8 1 8 2 8 4 8 78 Kb A B C D E 23,1 9,4 6,5 4,3 2,3 LBPA: C67 (1...10) C72 (1...10) 10 pases en LB 1000 colonias Amp sensibles= 70 LBP y LBPA PC1C2S1 No. 2 No. 1 SONDAS

6 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V. cholerae DE GENERACIÓN 2 Inserción del gen celA en el gen de la hemaglutinina proteasa Cepas de generación 1 de V. cholerae Cepas de Generación 1 8 1 y 4 13 E.coli SM10 pir (donante 2) Hemaglutinina proteasa Conjugación Pases y Selección cel A Estrategia

7 Obtención de CGM de V. cholerae por reemplazamiento hap por hap::celA 8 1 4 13 6 1,4,9,10 6 3 13 1...10 6 31 6 38 133 2 133 3 Kb A B D E 23,1 6,5 4,3 2,3 LBPA: 6 (1...10) 13 (1...10) 10 pases en LB Amp sensibles= 21 PC1S1 1000 colonias LBP y LBPA No. 4No. 3 SONDAS 9,4

8 Niveles de toxina colérica en las cepas progenitoras y modificadas

9 Detección de la hemaglutinina proteasa (Hap) en las cepas progenitoras y genéticamente modificadas Carriles 1: C7258 2: 8 1 3: 63 1 4: 63 8 5:C6706 6:4 13 7:133 3 La detección de Hap fue realizada con una preparación de anticuerpo policlonal anti-Hap odtenido en conejo. (Anticuerpo donado por el Dr. Richard Finkelstein) Ensayo de ‘Western blot’

10 Detección de la actividad celulolítica de las cepas vacunales de V. cholerae de generación 1 y 2 A: Western blot con anticuerpos policlonales anti Cel A obtenidos en conejo: Carriles: 1(413); 2 (1333), 3 (81); 4 (631; 5 (638) B: Actividad celulolítica de las cepas vacunales en geles de poliacrilamida (geles de Beguin) C: Actividad celulolítica de la cepa 638 en placa petri C

11 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA DETERMINAR LA DOSIS DE TRABAJO CON LAS CEPAS VACUNALES DE GENERACIÓN 1 Y 2 9 grupos de ratones balb/c lactantes fueron inoculados con las cepas de V. cholerae que se indican y a las dosis señaladas Cepa C6706 Cepa C7258 10 3 10 4 10 5 N = 12 N = 81 N = 90 N = 39 N =113 Inóculo Vehículo N = 39 Controles Se determinó la sobrevivencia de los animales en los grupos y se compararon entre si. Se empleó el método de log Rank

12 Selección de la dosis de trabajo Conclusión La dosis 10 5 UFC de C6706 o C7258: 100 x dosis letal 100%

13 DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EVALUAR LA VIRULENCIA Y LA CAPACIDAD DE COLONIZACIÓN DE LAS CEPAS VACUNALES DE GENERACIÓN 1 Y 2 Subgrupo 1: Se determina la sobrevivencia Subgrupo 2: Se determina la capacidad de colonización del intestino delgado UFC/cm 2 Se inoculan los ratones Balb/c lactántes con la dósis de trabajo (10 5 UFC) Se divide cada grupo en dos subgrupos Diseño GRUPOS Cepa 4 13 Cepa 133 3 Cepa 8 1 Cepa 63 1 N = 75/grupo Cepa 63 8

14 Virulencia y colonización de las CGM (Dosis 105) -Panel superior: Virulencia. Gráfico de Kaplan-Meier -Panel inferior: Colonización en intestino delgado

15 CEPAS Log UFC/mL 1 -Log UFC/mL 2 F1 3 F9 4 6380.760.64 CVD103-HGR0.860.71 Efecto de dos formulaciones sobre la viabilidad de dos cepas liofilizadas 1 Log UFC/mL antes del proceso de liofilización. 2 Log UFC/mL después del proceso de liofilización. 3 Formulación compuesta por: lactosa, peptona bacteriológica y sorbitol. 4 Formulación compuesta por: leche descremada, peptona bacteriológica y sorbitol.

16 PERDIDA DE VIABILIDAD DE LA CEPA 638 EN DOS FORMULACIONES Y EN DIFERENTES TIEMPOS

17 AcM IsotipoEspecificidadUtilidad 1G10G5 IgG2a CT-A, reacciona con CT-1 (toxina de V. cholerae O1, clásica) y CT-2 (toxina de V. cholerae O1, El Tor). GM-1 ELISA Western Blot 4D1G5 IgG2a CT-B, REACCIONA CON CT-1 (TOXINA DE V. CHOLERAE O1, CLÁSICA) Y CT-2 (TOXINA DE V. CHOLERAE O1, EL TOR). GM-1 ELISA Western Blot 2F12F1 IgG3 MSHA de cepas de V. cholerae O1 y O139.ELISA Wester Blot 10E10E1 IgG2a TCP DE CEPAS DE V. CHOLERAE O1 (BIOTIPOS CLÁSICO Y EL TOR) Y CEPAS DE V. CHOLERAE O139. ELISA Wester Blot 4D6F9 IgG1 TCP DE CEPAS DE V. CHOLERAE O1 (SOLAMENTE BIOTIPO EL TOR) Y CEPAS DE V. CHOLERAE O139. ELISA Wester Blot 6G1E12F1 IgG3 LPS de V. cholerae O1 (serotipos Ogawa e Inaba), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139. ELISA, Wester, Aglutinación y Vibriocida 4D2G5 IGg2b LPS de V. cholerae O1 (serotipos Ogawa e Inaba), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139 ELISA, Wester, y Vibriocida 2B4 IgG1 LPS de cepas de V. cholerae O1 (solamente serotipo Ogawa), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139 ELISA, Wester, Aglutinación y Vibriocida 9A11D6 IgG1 LPS de cepas de V. cholerae O139, no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O1 ELISA, Wester, Aglutinación y Vibriocida Anticuerpos Monoclonales y Métodos de Detección

18 PATENTE CONCEDIDA

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20 FIN