INTRODUCCIONDISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS Se han identificado receptores de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRHr) en células de granulosa.

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1 INTRODUCCIONDISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS Se han identificado receptores de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRHr) en células de granulosa ovárica (CG) y luteales. La activación de GnRHr en CG regula la función gonadal. Experiencias “in vivo” e “in vitro” de la regulación hormonal con agonistas de GnRH demostraron, en ovarios de ratas, un incremento en la atresia folicular. En nuestro laboratorio se determinó que el LA induce apoptosis de manera dosis dependiente y creciente con la concentración cuando se incuban BGC-1, células de línea establecida de granulosa bovina, con 1, 10 y 100 nM LA. Con el objetivo de analizar el comportamiento de células de cultivo primario de granulosa de ovario bovino (CPGB), se realizaron 23 punciones de folículos de 3-8 mm y se analizó el efecto apoptótico de 1,10 y 100 nM LA por 24 y 48 hs de incubación a nivel morfológico, por tinción con hematoxilina y DAPI. Se realizaron también ensayos de actividad de caspasa 3, y citometría de flujo para la exposición de P-serinas mediante marcación con Anexina V-FITC y PI. RESULTADOS a) Cultivos celulares: Se trabajo con células de granulosa bovina (CPGB), obtenidas por punción de folículos de 3-8 mm (310 células/mm2) durante 48 hs, en DMEM + F12 suplementado con 5% SFB, Glutamina (2 nM), Gentamicina (50 mg/l), CO2 al 5% y humedad a saturación, hasta la inducción. b) Tratamientos: 1) SFB 5% 2) SFB 5% + LA 1 nM 3) SFB 5% + LA 10 nM 4) SFB 5% + LA 100 nM Tiempo de incubación: La inducción hormonal se frenó a 24 y 48 Hs de incubación. c) Metodología de Evaluación: DAPI: Las células se fijaron con metanol absoluto y teñidas con DAPI (5 µg/ml) durante15 minutos y montadas en medio sintético DPX. La observación se hizo en microscopio de luz UV, 365nm. Se determinó el porcentaje de núcleos correspondientes a células con morfología de apoptosis sobre el total de células evaluadas con objetivo de 40X. Hematoxilina: Teñidas por 15 min. con Hematoxilina y viradas con agua tibia por otros 5 min., se realizó el conteo de figuras de apoptosis y mitosis en microscopio de campo claro (150X). Análisis FACS: Se analizó la exposición en superficie de las fosfatidil serinas marcándolas con Anexina V (AV) recombinante conjugada a FITC y Ioduro de Propidio (IP) para analizar la integridad de membrana. Las determinaciones de intensidad de fluorescencia para 15.000 células por muestra fueron analizadas por citometría de flujo (FACS). Los datos se analizaron con el programa Winmdi. Annexin-V FITC Conjugate (recombinant), Invitrogen. Caspasa 3: Se rastrillarón las células, se resuspenden en 10 ul de buffer de lisis y se mantienen a -80ºC. Se llena una placa de ELISA con estándares de concentración de producto, p-nitro anilina (P-NA) y las muestras en buffer de reacción con el sustrato, Acetil-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilina (Ac-DEVD-pNA). Se lee a tiempo 0 y a las 20 hs de incubación a 37 ºC a 405 nm. Caspase 3 Assay Kit, colorimetric, Sigma. Análisis Estadístico: Se realizaron dos experimentos por triplicado para 24 Hs de incubación para tinción con hematoxilina y DAPI y tres por triplicado para Caspasa 3 y Anexina V. Los resultados fueron analizados por ANOVA de dos vías y test de comparación múltiple de Dunnett respecto del control para Hematoxilina y Bonferroni para el resto. CONCLUSIONES DAPI: Se observó aumento significativo de la apoptosis para 1 nM LA (40X). FACS – Anexina V: Se realizaron 3 experimentos para CPGB tratados por 24 hs. Los resultados obtenidos no fueron los adecuados para realizar un análisis estadístico. Sin embargo se pudo observar la tendencia del LA 100 nM para inducir mayor apoptosis temprana y total comparada con el control, observándose además, la tendencia del ANTIDE de proteger a las células del efecto inductor del LA. Asimismo, se observó también mayor inducción de apoptosis con 1 que con 100 nM de LA en algunos cultivos. En cultivos de células de granulosa obtenidas por punción de folículos de ovario bovino (CPGB), se observó a nivel morfológico activación significativa de la apoptosis inducida por LA. La inducción es dosis dependiente e inversamente proporcional a la concentración (1, 10 y 100 nM LA) para densidades de células por campo menores a 9, comportándose los cultivos con más de nueve células por campo de modo similar al de las BGC-1. Del mismo modo se observó un incremento en la inducción de la apoptosis correlativo con las dosis crecientes de LA. Los cultivos de menor densidad se comportan de manera más compleja y errática, pero suele repetirse el efecto observado en el análisis morfológico utilizando DAPI como fluoróforo indicador del estado de la cromatina celular. Este efecto de dependencia de la densidad celular es difícil de prever en cultivos primarios ya que depende de diversos factores. Por esta misma razón, durante el análisis in vitro mediante citometría de flujo y actividad de Caspasa 3, tampoco se observó un comportamiento estable del efecto dosis dependiente bajo la inducción con LA. Hematoxilina: Experimentos con densidad mayor a 9 células por campo (150X). Apoptosis significativa con 100 nM LA. Actividad de caspasa 3: Se realizó un ensayo de actividad de caspasa 3 (tres experimentos por triplicado) sobre placas de 100 mm., observándose diversidad de respuesta (posiblemente debida a la variable “densidad celular”). Las respuestas, en promedio, no fueron significativas, pero sí se observaron las distintas y típicas respuestas vistas anteriormente para otras técnicas de determinación de la apoptosis. En dos de los tres experimentos analizados se observó tendencia a la activación de la caspasa 3 para 1 nM de LA, en cambio, en el tercero el aumento se dio de forma creciente a la concentración de LA. FechaApoptosis Basal Células/campo Densidad (150X) Apoptosis medida por tinción con Hematoxilina para 24 hs de incubación con 1, 10 y 100 nM LA en BGC-1. 8/10/081,69%7,58Aumenta 27% con 1nM, baja en 10 y sube con 100 a casi el nivel de 1 nM. 4/12/083,9 %8,37Aumenta 11% con 1 y 10 nM pero con 100 nM LA disminuye o no se modifica. 4/12/083,64%8,8Aumenta 15% con 10 nM y baja con 1 y 100 nM LA. 9/03/091,21%9,22Aumenta de manera creciente con la concentración, IA: 1,59 con 100 nM LA. Experimento de 48 hs de incubación con baja densidad de células por campo. Experimento de 48 hs de incubación con alta densidad de células por campo. * APOPTOSIS EN CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS DE GRANULOSA DE OVARIO BOVINO: ASPECTOS MORFOLÓGICOS Y DEPENDENCIA DE LA DENSIDAD DE CÉLULAS CAROU, MC.; CRUZANS, P.; FIORITO, CD.; REVILLA, M.; LOMBARDO, DM. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal – INITRA Cátedra de Histología y Embriología - Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad de Buenos Aires Chorroarín 280 (1427), Buenos Aires, Argentina Mitosis Apoptosis Hematoxilina y Eosina de CPGB. Se pueden observar figuras de Mitosis (metafase) y cuerpos apoptóticos.