Aplicación de los marcadores moleculares al estudio de la biodiversidad del ganado bovino cubano Autora: Lic. Odalys Uffo Reinosa Tutores: Dr. Rodrigo.

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1 Aplicación de los marcadores moleculares al estudio de la biodiversidad del ganado bovino cubano Autora: Lic. Odalys Uffo Reinosa Tutores: Dr. Rodrigo Ronda Dra. Rosario Osta Dra. Rosario Osta Asesora: Dra. Siomara Martínez 2003

2 ·Incrementar la potencialidad productiva del ganado existente. ·Desarrollar sistemas de explotación adecuados a las condiciones tropicales. Ganadería Cubana (1960’) Polimorfismos Bioquímicos Citogenética Técnicas Moleculares Incremento de la eficiencia de los programas de mejora Programas de conservación de Recursos Genéticos Nacionales Principios de 80´ Programa Nacional de Mejora Genética Núcleos Autóctonos  Criollo de Cuba  Cebú Cubano Nuevas razas  Siboney de Cuba Genoma Bovino Conocimiento científico Mantenimiento de la riqueza genética Identificación de marcadores genéticos:  “loci” proteínas lácteas  “loci” microsatélites

3 Hipótesis La variación molecular en los “loci” de las seis proteínas lácteas y de 30 microsatélites refleja la variabilidad y las asociaciones genealógicas de las razas bovinas cubanas Criollo, Siboney y Cebú, entre sí y con sus posibles ancestros. Objetivo General Aplicación de los marcadores moleculares a la caracterización de las tres razas bovinas. Objetivos Particulares  Conocer la estructura genética de las tres razas de ganado bovino cubano incluidas en este estudio a través de las proteínas lácteas  Analizar 30 microsatélites, recomendados por la FAO para estudios de biodiversidad, en las tres razas cubanas analizadas  Indagar sobre las posibles relaciones entre las tres razas bovinas cubanas estudiadas y algunas razas españolas

4 Razas: Razas: Criollo de Cuba (50 vacas, U-073 EPG Los Naranjos) Cebú Cubano (50 vacas, U-681, EPG Los Naranjos) Siboney de Cuba (42 vacas, U-002, 020, 038, 8 toros en prueba de progenie) EPG Nazareno Obtención del material genético: Sangre Periférica: Método rápido (Osta, 1994) Precipitación Salina (Miller et al., 1988) Semen: Dos métodos rápidos (Tompsen et al., 1991; Lucy et al., 1993) Chequeo de concentración y pureza Electroforesis agarosa 0.8% DO 260/280 Materiales y Métodos Generales

5 Tipificación de los genes de las proteínas lácteas Loci: Loci:  s1 -caseína (CASA1) (Lien et al., 1993)  -caseína (CASB) (Medrano y Sharrow, 1991)  s2 -caseína (CASA2) (Osta, 1994)  -caseína (CASK) (Osta, 1994)  -lactoglobulina (LAA) (Osta, 1994)  -lactoglobulina (LGB) (Medrano y Aguilar-Córdova, 1990) 50mM KCl 10mM Tris-HCl, pH 8.8 1.5mM MgCl 2 0.1% Tritón X-100 0.2mM dNTPs 75pmol c/primer Mezcla de PCR LocusEnzima CASA1HphI CASBMspI CASA2MnlI CASKHindIII LAAMspI LGBHaeIII Mezcla de digestión 10  L amplicón 1U enzima 1.5  L buffer de la enzima H 2 O hasta V f =15  L Incubar a 37°C por 3h Materiales y Métodos Generales

6 Tipificación de los “loci” microsatélites Loci: Proyecto MoDAD Loci: Proyecto MoDAD http://www.projects.roslin.ac.uk/cdiv/markers.html Reacciones de PCR: Reacciones de PCR: http://www.ir.bbsrc.ac.uk/cdiv_www Visualización de las reacciones: Visualización de las reacciones: Autorradiografía Muestras controles de talla: Muestras controles de talla: Donadas por Dra. Zaragoza, Univ. Zaragoza, España. Materiales y Métodos Generales

7 Análisis estadístico Variación dentro de la población:  BIOSYS-1 (Swofford y Selander,1989)  MICROSAT (Minch, 1997)  GENEPOP 3.1(Raymond y Rousset, 1995)  BOTTLENECK (Piry et al., 1999) Variación entre poblaciones:  GENEPOP 3.1(Raymond y Rousset, 1995)  MICROSAT (Minch, 1997)  DISPAN (Ota, 1993)  PHYLLIP (Felsenstein, 1993)  TREEVIEW (Page, 2001)  GENETIX (Montpellier, France)

8 Caracterización poblacional

9 Estructura genética para las proteínas lácteas 0.950.640.58 0.050.360.42 CASA1BC Cebú Cubano Siboney de Cuba Criollo de Cuba Grupo genético Variantes 0.100.310.10 0.900.690.90CASBAB 1.001.001.00CASA2A 0.160.220.30 0.840.780.70CASKAB 0.600.560.61 0.400.440.39LAAAB 0.760.800.70 0.240.200.30LGBAB Tabla 10. Frecuencias alélicas de las diferentes variantes de las proteínas lácteas

10 Estimación de la diversidad genética Tabla 11. Valores de heterocigosidades medias observada (Hobs) y esperada (Hesp), número medio de alelos (A), porcentaje de loci polimórficos (P 0.95 ) para los loci de las proteínas lácteas, coeficiente de consaguinidad (F). -0.03-0.04-0.09Ftotal 83.3% 66.7%P 0.95 1.8 (0.2) A 0.334 (0.081)0.340 (0.074)0.211 (0.076)Hesp 0.344 (0.086)0.355 (0.103)0.230 (0.100)Hobs CriolloSiboneyCebú Equilibrio de Hardy-Weinberg Loci en desequilibrio Cebú: CASB (p<0.001) Siboney: LAA (p<0.001) y LGB (p<0.05) Estructura genética para las proteínas lácteas

11  Se confirmó la presencia de genes Bos indicus, en el ganado Criollo de Cuba, dada por las frecuencias de CASA1 C ( =0.58) y LAA A ( =0.39)  En las tres razas, cinco de los seis loci estudiados resultaron polimórficos, con un porcentaje de loci polimórficos que osciló entre 66.7 y 83.3%.  El rebaño Criollo de Cuba analizado se encuentra en equilibrio genético para todos los loci, a diferencia del Siboney de Cuba que está en desequilibrio para los loci LGB y LAA, así como el Cebú Cubano para el CASB. Conclusiones parciales Estructura genética para las proteínas lácteas

12 Estructura genética para los “loci” microsatélites Rango de tallas alélicas: Concuerda con los descritos para los 30 loci microsatélites (http://www.androclus.vet.uu.nl/resgen/) Variación intra-razas: Total de alelos por razas: Cebú--221 Siboney--232 Siboney--232 Criollo--219 Criollo--219 Número de alelos por locus: 6 (INRA63, INRA005) y 18 (TGLA53) Promedio de número de alelos por locus: 10.3 Alelos predominantes diferentes en cada locus, excepto: INRA023--215pb TGLA126--119pb SPS115--244pb SPS115--244pb

13 -0.0261007.3 (0.4)0.76 (0.01)0.78 (0.02)Criollo 0.0391007.7 (0.4)0.76 (0.02)0.73 (0.03)Siboney 0.0141007.4 (0.4)0.72 (0.03)0.71 (0.03)Cebú F P 0.95 AHespHobsRaza Tabla 13. Heterocigosidades medias observada (Hobs) y esperada (Hesp), número medio de alelos (A), porcentaje de loci polimórficos (P 0.95 ) y coeficiente de consanguinidad (F) en las tres razas cubanas analizadas por medio de la tipificación de 30 microsatélites (los errores estándar se muestran entre paréntesis) Variación intra-razas 78 Alelos “específicos”: Criollo de Cuba--29, Cebú Cubano--27 y Siboney de Cuba--22, distribuidos en 27 de los 30 loci analizados. distribuidos en 27 de los 30 loci analizados. 15 alelos únicos   0.1: 4 alelos Siboney, 6 alelos Criollo y 5 alelos Cebú Estructura genética para los “loci” microsatélites

14 Equilibrio de Hardy-Weinberg (HW):  Cebú Cubano: 23.3% de loci fuera del equilibrio.  Siboney y Criollo: 40% de los loci en desequilibrio.  10 loci se encuentran en equilibrio HW en las tres poblaciones.  loci HEL5, HAUT24 y TGLA227: Desviaciones del equilibrio en las tres razas.  Diferenciación genética entre las razas fue significativa para todos los loci  Diferenciación genética entre las razas fue significativa para todos los loci. Estructura genética para los “loci” microsatélites

15 Variación intra-razas Figura 7. Distribución de frecuencias por clases en cada población Estructura genética para los “loci” microsatélites

16 Leyenda:SiboneyCriolloCebú Relaciones entre individuos

17 Relaciones genéticas entre razas: Cebú Cubano Siboney de Cuba 0.2449 Criollo de Cuba 0.29230.2315 Tabla 17. Matriz de distancias D A entre las tres razas bovinas cubanas obtenidas a partir de frecuencias de loci de los microsatélites Figura 8. Dendogramas que muestran las relaciones genéticas entre las razas cubanas estudiadas. Árboles filogenéticos construidos a partir de las distancias D A (A) por el método de Neighborn-Joining, y (B) por el método UPGMA, para los loci microsatélites Estructura genética para los “loci” microsatélites Siboney Criollo Cebú B Cebú ACriolloSiboney

18 Figura 9. Agrupación de individuos por razas Relaciones genéticas entre razas: 550,6355920.166 Siboney vs Criollo 657,7427000.196 Cebú vs Criollo 453,5254890.137 Cebú vs Siboney 95% IC* T.divergencia(generaciones) D TL Razas *95% IC: intervalo de confianza para una probabilidad del 95% para los tiempos de divergencia Tabla 17. Tiempos de divergencia estimados para las tres razas de ganado bovino cubano basados en las distancias D TL estimadas para los 30 microsatélites. Cebú Siboney Criollo Estructura genética para los “loci” microsatélites

19 Comparación con razas españolas:  Asturiana de los Valles  Asturiana de los Montes  Morena (Rubia Gallega)  Casta Navarra  Betizu  Pirenaica  Toro de Lidia  Menorquina (Martín-Burriel et al., 1999, 2003) Promedio de número de alelos por locus en razas cubanas (10.3) superior a las razas españolas (8.6). Hobs y Hesp superiores en razas cubanas Mayor número medio de alelos por locus (A españolas : 6.8) Mayor porcentaje de loci polimórficos (P 0.95, españolas : 96.7-100%) Mayor variabilidad genética en las razas cubanas 51 alelos diferentes a razas españolas: Cebú Cubano: 20 alelos Cebú Cubano: 20 alelos Siboney de Cuba: 19 alelos Siboney de Cuba: 19 alelos Criollo de Cuba: 12 alelos Criollo de Cuba: 12 alelos Estructura genética para los “loci” microsatélites

20 Asturiana de los Montes Pirenaica A Siboney Cebú Criollo Asturiana de los Valles Morenas De Lidia Casta Betizu Menorquina 13 32 48 7599 95 66 54 Casta De Lidia Pirenaica Menorquina Betizu Asturiana de los Montes Asturiana de los Valles Morenas Criollo Siboney Cebú B 83 48 31 54 80 94 76 56 Comparación con razas españolas: Figura 10. Dendogramas que muestran las relaciones genéticas entre las razas cubanas estudiadas y ocho razas españolas (D A ) Estructura genética para los “loci” microsatélites

21   Hay una elevada variabilidad en las tres poblaciones cubanas, dado por los valores de heterocigosidades, número medio de alelos por locus, porcentaje de loci polimórficos y los coeficientes de consanguinidad.   Se identificaron alelos específicos para cada población, útiles para caracterización racial.   Se confirmó la relación filogenética, a través de las distancias genéticas, entre las poblaciones cubanas y sus posibles ancestros, observándose mayor cercanía entre el ganado Criollo de Cuba y las razas españolas Morena y Asturianas. Conclusiones parciales Estructura genética para los “loci” microsatélites

22  Resultados obtenidos del estudio poblacional  Elevada variabilidad en las tres razas cubanas  No existe consanguinidad en las poblaciones cubanas, según los métodos estadísticos aplicados Consideraciones generales  Determinación de las relaciones filogenéticas   Existe menor distancia genética entre el Criollo y el Siboney   Cercanía filogenética del Criollo con las razas españolas del suroeste y noroeste de la Península Ibérica.  Marcadores raciales   Elevadas frecuencias de los alelos CASA1 C y LGB B y la presencia en nuestras razas del alelo LAA A   Identificación de alelos característicos de Bos indicus   Identificación de 51 alelos específicos de los loci microsatélites que no han sido descritos en la literatura consultada, distribuidos en las tres razas cubanas   Estudios de caracterización racial   Discriminar entre individuos de una raza u otra

23  En las poblaciones bovinas estudiadas existen alelos, tanto de las proteínas lácteas como de los microsatélites, que permiten establecer un patrón racial molecular, característico para cada una de ellas.  Existe alta variabilidad genética en el Criollo de Cuba, el Cebú Cubano y el Siboney de Cuba.  El Cebú Cubano se encuentra más alejado filogenéticamente del Siboney y del Criollo de Cuba y este último se encuentra más cercano de las razas españolas, que se reportan como las que probablemente fueron introducidas en América en épocas de la colonización. Conclusiones Generales

24  Realizar estudios de asociación entre las características productivas del ganado bovino cubano y sus características genéticas.  Extender este estudio a otras razas cubanas de interés genético.  Vincularnos a estudios de comparación racial de nuestras poblaciones con otros grupos genéticos autóctonos del continente americano o de Europa. Recomendaciones

25 Muchas Gracias