Manipulación de DNA Clonación Curso 2011-12.

Presentación del tema: "Manipulación de DNA Clonación Curso 2011-12."— Transcripción de la presentación:

1 Manipulación de DNA Clonación Curso

2 ¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula?
El problema básico ¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula? Uniéndolo a un vector de clonacion

3 Vector de clonacion DNA de replicación autónoma Multicopia
Dianas de restricción unicas Fenotipo seleccionable

4 Diana única

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7 Plásmidos recombinantes
Quimeras

8 Pasos en la clonación Restricción del vector y del inserto Ligación Transformación Crecimiento en placas de agar en medio selectivo

9 Fragmentación de DNA Enzimas de restricción

10 Werner Arber Premio Nobel de Medicina en 1978
"for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics".

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12 dabalearrozalazorraelabad
Eje de simetría doble DIANAS de restricción Secuencias palindrómicas dabalearrozalazorraelabad ana anna

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14 Romos Protuberantes

15 Enzimas de restricción Nº fragmentos en genoma humano
Probabilidad de corte nomenclatura Nº fragmentos en genoma humano 1/4 x 1/4x 1/4 x1/4= (1/4)4 =1/256 1/4 4 ~ 12.5x106 fragmentos (1/4)6 = 1/4096 6 ~ fragmentos (1/4)8 = 1/65536 ~ fragmentos 8

16 Isosquizómeros Enzimas de restricción que reconocen la misma sequencia
Pueden cortar en el mismo sitio Como NdelI y MboI GATC O no NarI GG CGCC BbeI GGCGC C EheI GGC GCC KasI G GCGCC

17 Ligación de DNA

18 3´ 5´

19 Animaciones> manipulación de DNA>
techniques> cutting & pasting

20 Truco para favorecer la formación de recombinantes
Impedir la religación del vector

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22 Extremos cohesivos compatibles
¿Podríamos digerir el recombinante con BamHI?

23 ….NGAT ATCN….. ….NCTA TAGN….. ….NGAT ….NCTA ATCN….. TAGN….. ….NCTA ….NGAT CCTN….. GGAN….. ….NCTA ….NGAT CCTN….. GGAN…..

24 Animación > Manipulation >Revolution > Players
Premio Nobel de Química 1980

25 Vectores de clonacion Vectores plasmídicos

26 Características de los vectores de clonación
Pequeño tamaño Marcador genético de selección Sitios únicos de restricción

27 ColE1

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33 Vectores mejorados Mutación en las secuencias control de la replicación de ColE1 resultantes en más de 500 copias/célula Adición de múltiples sitios de clonaje únicos (MCS) (“poly-linker”)

34 MCS (Multi Cloning Site)

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36 (polylinker)

37 MCS de pUC18

38 MCS de pUC19

39 MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.

40 pUC Plac O N-lacZ pUC Plac O N-lacZ XGal IPTG

41

42 pUC Plac O N-lacZ pUC Plac O N-lacZ XGal IPTG

43 Inductor IPTG Allolactosa Isopropil b D tiogalctósido INDUCTOR
no hidrolizable

44 Ensayo de b-galactosidasa
X-gal

45 MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.
Selección de plásmidos con inserto: colonias blancas en placas con IPTG y X-Gal.

46 + X-gal + X-gal Colonias blancas Colonias azules

47 Animación> clonación / clonación (vectores plasmídicos)
+ IPTG Animación> clonación / clonación (vectores plasmídicos)

48 + inserto - inserto

49 Vectores lanzadera Shuttle

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