BIOTECNOLOXÍA E ENXEÑERIA XENÉTICA

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1 BIOTECNOLOXÍA E ENXEÑERIA XENÉTICA

2 GRUPO DE TRABALLO DE SELECTIVIDADE 19
GRUPO DE TRABALLO DE SELECTIVIDADE A ENXEÑERÍA XENÉTICA E AS SÚAS APLICACIÓNS - Como unha introducción á inxeniería xenética, ademais da PCR (xa mencionada), explicar un experimento sinxelo de clonación no que interveñan o ADN que ten que ser clonado, os encimas de restricción, un plásmido e bacterias. Comentar a producción de moléculas recombinantes por enxeñería xenética moi útiles para a nosa especie (producción de hormonas como por exemplo a insulina ou a hormona do crecemento, ou producción dalgunhas vacinas como as da hepatite A e B). É interesante comentar as repercusións económicas, sociais e éticas que prantexa á nosa sociedade a manipulación xenética.

3 Noticia inicial Diario de la Ciencia Logran insertar un gen de una especie extinta en un animal vivo Científicos australianos han conseguido implantar un gen del tigre de Tasmania (Thylacinus cynocephalus), un carnívoro extinto y similar a un lobo, en el ADN de un ratón de laboratorio para observar su función. Para realizar este experimento, que ha tenido lugar durante el año 2008 en la Universidad de Texas, los científicos han escogido tejidos de un tigre de Tasmania, un marsupial carnívoro extinto en 1986, del que se conservan restos en etanol en el Museo Victoria de Melbourne. Los científicos han logrado aislar el gen Col2a1 a partir del ADN contenido en los tejidos y lo han insertado en un embrión de ratón, para comprobar qué función desempeñaba. Como resultado se ha observado que el gen en cuestión participaba en el desarrollo del cartílago del ratón, que posteriormente daría lugar al hueso. El objetivo del experimento, según han señalado los investigadores, es llegar a comprender cómo funciona la biología de especies que ya no existen y comprobar si esto tiene alguna utilidad en el desarrollo de nuevos medicamentos. «Es la primera vez que el ADN de un animal extinguido se usa para inducir una respuesta en otro organismo vivo. Si cada día desaparecen más animales, se perderá una información crucial sobre el potencial de sus genes y, de este modo, podemos investigar la función que tenían en ese ser vivo», ha señalado Andrew J. Pask, director de la investigación. El último tigre de Tasmania del que se tiene noticia cierta falleció en el zoológico de Hobart, en la isla de Tasmania, en 1936. Desde entonces, pese a algunas noticias inciertas de observaciones de este animal en libertad, no se ha podido probar la existencia de tigres de Tasmania en libertad, por lo lo que en 1986 se declaró oficialmente extinto.

4 ESQUEMA DA UNIDADE 1- Definición de biotecnoloxía e de enxeñaría xenética 2- Técnicas: 1- Enzimas de restricción 2- ADN complementario por hibridación 3- Vectores de clonación en procariotas e en eucariotas 4- Amplificación de ADN: clonación por PCR 5-Identificación de clones mediante sondas: Hibridación 6- Secuenciación de AN 7- Genotecas 3- Aplicaciones: 1- Farmacolóxicas: Proteínas terapéuticas (insulina,GH, factor coagulación VII,encimas) Vacinas Anticorpos monoclonais Terapia xénica Diagnóstico de enfermidades 2- Medicina forense: identificación, probas de paternidade 3- Agricultura: resistencias, mellores características 4- Gandaría: animais transxénicos 5- Medio ambiente: Biorremediación e bioadsorción 6- Proxecto xenoma humano - Proteómica 4- Bioética

5 1- ER: Fragmentación del ADN La piedra angular de la tecnología del ADN recombinante es un tipo de enzimas llamadas endonucleasas de restricción o restrictasas. Estas enzimas, aisladas de bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleico invasor. Su funcionamiento se debe a que reconocen una secuencia específica de nucleótidos (sitio de restricción) de una molécula de ADN de doble cadena, por donde la cortan. Hay dos tipos de enzimas de restricción: las de Tipo I, que cortan las cadenas del ADN en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción, y las de Tipo II, que cortan la cadena con absoluta precisión dentro del sitio de restricción. Esto hace que sean las enzimas de Tipo II las que se usen ampliamente en la investigación del ADN recombinante. La secuencia de restricción de estas enzimas es una región específica y palindrómica, es decir, la secuencia de una de las cadenas leída en dirección 5’®3’ es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en dirección 5’®3’ (las secuencias se leen igual en ambas direcciones). Las enzimas de restricción, al cortar el ADN generan los llamados fragmentos de restricción que se separan por electroforesis sobre geles. Comparando los tamaños de los fragmentos de restricción formados a partir de una región génica determinada, tras el tratamiento con varias restrictasas, se puede confeccionar un mapa de restricción de esa región que muestre la localización de cada punto de corte. Las variaciones en los tamaños de los fragmentos se denominan polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). Estos polimorfismos han resultado ser muy valiosos para señalar la localización exacta de genes y determinar la identidad o parentesco de individuos.

6 Unión de los fragmentos de ADN Para poder soldar fragmentos de ADN obtenidos con restrictasas, sus extremos han de ser complementarios entre si para que puedan formarse los puentes de hidrógeno entre bases complementarias. Se descubrió que la mayoría de las terminaciones de los fragmentos generados con restrictasas eran cohesivos (es decir, monocatenarios), lo que permitía una unión por complementariedad de bases. En este hecho se basan casi todos los procedimientos de clonación génica. Lo que se hace es cortar con el mismo enzima de restricción, tanto el ADN que se desea insertar en una célula como el ADN del vector, que actuará como un transportador para llevarlo hasta el cromosoma hospedador. Luego se usa la enzima ADN-ligasa para unir covalentemente los esqueletos azúcar-fosfato de los dos fragmentos, produciéndose, así, una molécula de ADN recombinante.

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8 Exemplos de encimas de restricción.

9 Mecanismo de síntesis del ADN complementario
2- ADN complementario: Obtenemos un gen eucariota para poder introducir en una bacteria y clonarlo. Mecanismo de síntesis del ADN complementario Cadena de poliA Cebador de oligodT Transcriptasa inversa viral NaOH que deforma el ARNm ADN-polimerasa I ADN de doble cadena ARNm Lazo en horquilla ADN Nucleasa S1

10 3- Transformación de las células mediante vectores
Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de ADN puede llegar a entrar en una célula huésped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, moléculas de ADN transportadoras. Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas características: 1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de ADN que transporta. 2. Debería contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima. 3. Debería tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tenga) para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen. 4. El vector de la célula huésped debería ser fácil de recuperar. Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: plásmidos, bacteriófagos y cósmidos.

11 Los plásmidos son moléculas extracromosómicas de ADN de doble cadena de origen natural que tienen un gen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células bacterianas. Los plásmidos naturales que se conocen no tienen características ideales (suelen ser demasiado grandes) y, por ello, se elaboran plásmidos artificiales mediante ingeniería genética., de manera que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibióticos específicos. Los plásmidos generalmente están limitados a insertos de 5-10 kb.

12 Entre los bacteriófagos más utilizados como vectores, destaca el fago lambda, que tiene un genoma de sólo 49 kb empaquetado en una cabeza proteica unida a una cola que permite su inyección dentro de una bacteria; dentro de ésta, mediante el ciclo lítico, inducirá la formación de cientos de copias iguales de su ADN, con lo que se consigue una clonación del genoma de dicho fago. La principal ventaja de usar vectores fágicos es que el ADN extraño se empaqueta junto con el ADN del fago, formando ambos el ADN recombinante dentro de su cubierta proteica y penetra en las bacterias por el sistema de inyección propio del virus. Esto aumenta enormemente la eficacia de la transformación bacteriana. Los vectores fágicos pueden acomodar insertos de ADN de unas 15 kb

13 Los cósmidos son vectores híbridos construidos utilizando partes del ADN del fago lambda y de ADN plasmídico. Contienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmídicas de replicación y de genes de resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los contienen. El ADN de los cósmidos, que contiene los insertos de ADN, se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas infectivas Una vez el cósmido entra en la célula huésped, se replica como un plásmido. Puesto que la mayoría del genoma de lambda se ha delecionado, los cósmidos pueden transportar insertos de DNA mucho más grandes que los que lambda puede llevar. Así, los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado; los vectores fágicos pueden acomodar insertos de ADN de unas 15 kb y los plásmidos generalmente están limitados a insertos de 5-10 kb.

14 Transferencia de ADN a eucariotas
Tanto las células animales como las vegetales pueden incorporar ADN del medio ambiente mediante el proceso denominado transfección. Además, esto también se puede conseguir mediante vectores, incluyendo los YAC (cromosomas artificiales de levadura). A las plantas o animales que contienen un gen exógeno se denomina transgénicos. Células de mamífero Las células de mamífero pueden incorporar ADN por distintos métodos, como coprecipitación con fosfato cálcico y endocitosis, microinyección directa, exposición a pulsos cortos de alto voltaje (electroporación), biolística (bombardeo con microproyectiles) y por encapsulación del ADN en membranas artificiales (liposomas) seguido de su fusión con membranas celulares. El ADN también puede transferirse utilizando YAC y vectores basados en retrovirus. Generalmente, el ADN introducido en una célula de mamífero por cualquiera de estos métodos se integra en el genoma del huésped. Los métodos de transferencia de ADN se han utilizado para: transferir genes a óvulos fecundados, produciendo así animales transgénicos; para investigar los aspectos moleculares de la expresión génica; y para replicar los genes clonados utilizando células de mamífero como huéspedes.

15 Células vegetales Por extraño que pueda parecer, se ha conseguido clonar utilizando plantas superiores como huésped y plásmidos bacterianos. La bacteria infecciosa Agrobacterium tumefaciens, presente en el suelo, produce tumores (agallas) en muchas especies de plantas. La formación de los tumores se asocia a la presencia de un plásmido inductor de tumores (Ti) en las bacterias. Cuando estas bacterias infectan células vegetales, un segmento del plásmido Ti, conocido como T-DNA, se transfiere al ADN cromosómico de la célula vegetal huésped. El T-DNA controla la formación del tumor y la síntesis de pequeñas moléculas conocidas como opinas, que son necesarias para el crecimiento de la bacteria infecciosa. Se pueden insertar genes exógenos en el segmento T-DNA de Ti, y la bacteria infecciosa puede transferir el Ti alterado a la célula vegetal. El ADN exógeno se inserta en el genoma de la planta cuando el T-DNA se integra en el cromosoma de la célula huésped. El crecimiento de esta célula genéticamente alterada puede inducirse en un medio de cultivo, formando una masa celular denominada callo. Manipulando el medio de cultivo, puede inducirse la formación de raíces y de brotes en el callo, y que éste se desarrolle eventualmente como plantas adultas que contengan el gen exógeno. La ventaja de trabajar con vegetales, frente a lo que ocurre en animales, es que se pueden conseguir organismos transgénicos sin necesidad de trabajar con células germinales, ya que se pueden obtener a partir de células adultas.

16 4- Clonación in vitro mediante PCR Hasta hace poco había una dependencia absoluta de las bacterias para clonar un gen, pero la asequibilidad de ADN polimerasas purificadas resistentes a la inactivación por altas temperaturas (Taq), junto con la posibilidad de sintetizar con gran facilidad oligonucleótidos a precios asequibles, han permitido el desarrollo de la técnica de clonación in vitro conocida como PCR (Polymerase Chain Reaction). Esta técnica se basa en la desnaturalización de una cadena de ADN y su posterior autoduplicación, de forma cíclica en un termociclador que se alimenta con la Taq, los oligonucleótidos y la muestra a clonar. Permite amplificar más de mil veces un fragmento de ADN, siempre y cuando se conozcan bien secuencias de los extremos que permitan la síntesis de oligonucleótidos complementarios. Estos oligonucleótidos se utilizarán como cebadores para la síntesis in vitro del ADN, catalizada por la Taq. Con esta técnica, son necesarios n ciclos de 3 etapas dada uno. En cada ciclo se hacen dos copias de cada molécula de ADN presente al inicio del mismo. Para conseguir una amplificación interesante, n debe tomar un valor entre 20 o 30. Cada ciclo requiere de un breve calentamiento (a unos 90 ºC) para separar las dos hebras de ADN (etapa 1). El éxito de esta técnica depende de la ADN polimerasa Taq que se aisló de una bacteria termófila (Thermus aquaticus), por lo que es mucho más estable a temperaturas elevadas que la polimerasa común, de modo que resiste los calentamientos repetitivos. Durante la 2ª etapa, el ADN hibrida con los cebadores mediante las secuencias complementarias situadas en los extremos del fragmento (generalmente se utilizan dos cebadores diferentes, cada uno con la secuencia complementaria a una de las dos cadenas). Finalmente, en la 3ª etapa, actúa la ADN polimerasa Taq, que incorpora los cuatro tipos de desoxirribonucleótidos trifosfato (A, C, G y T) en dirección 5’®3’ utilizando como molde el ADN unido al cebador.

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18 5- Selección de transformantes con ADN clonado Para replicar el ADN clonado se pueden utilizar distintos tipos de célula huésped. Uno de los más empleados es la cepa k12 de E. coli, ya que está bien caracterizada genéticamente y puede aceptar un amplio espectro de vectores. Las células huésped se hacen crecer en una placa de cultivo, donde formará colonias. Puesto que las células de cada una de las colonias provienen de una sola célula inicial, todas las células de la colonia, y los plásmidos que contienen, son genéticamente idénticas, o clones. Posteriormente se rastrean las colonias para identificar las que han incorporado el plásmido recombinante. Se utilizan varios métodos para seleccionar las colonias que contienen plásmidos con el inserto de DNA. Este proceso se denomina rastreo (o cribado). Por ejemplo, si el DNA que se desea clonar se inserta dentro del gen de resistencia a tetraciclina, este gen se inactivará. Después de transformar células huésped con el plásmido recombinante, éstas se hacen crecer en placas de cultivo que contienen el antibiótico ampicilina. Todas las células que hayan incorporado un plásmido (con o sin inserto) crecerán y formarán colonias, mientras que las células que no lo hayan incorporado morirán ya que son sensibles a la ampicilina. En el segundo paso, se identifican las colonias que contienen plásmidos con el inserto de ADN. En este paso, se transfieren las colonias de la placa que contiene ampicilina a una placa que contiene tetraciclina mediante un procedimiento denominado réplica. Las colonias que contienen el plásmido con el inserto no crecerán en la placa con tetraciclina, debido a que el inserto ha inactivado el gen de resistencia a tretraciclina. Entonces, el patrón de colonias de la placa con tetraciclina se compara con el de la placa con ampicilina, y se identifican las colonias de la placa con ampicilina que no han crecido en la placa con tetraciclina. Las células de estas colonias contienen vectores con el inserto de ADN, y se transfieren a un medio de crecimiento para nuevos análisis.

19 Selección de colonias que contienen un vector plasmídico que tiene dos genes de resistencia a antibióticos, uno para tetraciclina y otro para ampicilina. En este experimento, la presencia del inserto de DNA en el plásmido inactivará el gen de resistencia a la tetraciclina. Primero, se hacen crecer las células transformadas con el plásmido recombinante en un medio que contiene ampicilina. Como las células huésped son sensibles a ampicilina y el plásmido tiene un gen de resistencia a ampicilina, sólo crecerán aquellas células que hayan incorporado el plásmido. Se prepara una réplica de las colonias con un trozo de terciopelo estéril. Al presionar el terciopelo sobre la placa, algunas células de cada colonia se pegarán a él. Luego se presiona el terciopelo sobre la superficie de una placa que contiene tetraciclina. Las células que contienen los plásmidos con inserto no crecerán ya que se ha inactivado el gen de la tetraciclina. Comparando el patrón de colonias de la placa con tetraciclina con el de la placa original, las colonias que contienen el inserto pueden identificarse y recuperarse de la placa original, y pueden hacerse crecer para nuevos análisis.

20 Métodos de análisis de las secuencias clonadas Para responder a preguntas experimentales sobre la organización y la expresión de las secuencias clonadas se recurre a diversas técnicas, entre las que destacan la cartografía de restricción, la transferencia Southern, la secuenciación de ADN. Cartografía de restricción Un mapa de restricción es la recopilación del número, del orden y de la distancia entre los sitios de corte de enzimas de restricción en un segmento donado de DNA. Las unidades de mapa se expresan en pares de bases (pb) o, para largas distancias, en pares de kilobases (kb). Los mapas de restricción proporcionan información que puede utilizarse para subclonar fragmentos de un gen, o bien para comparar la organización de un gen y de su ADNc con el fin de identificar los exones y los intrones en la copia genómica del gen. Los fragmentos generados tras cortar el ADN con enzimas de restricción pueden separarse en función de su tamaño mediante electroforesis en gel, de manera que los fragmentos más pequeños se mueven más rápidamente. Los fragmentos aparecen como una serie de bandas que pueden visualizarse tiñendo el ADN con bromuro de etidio e iluminándolo con luz ultravioleta. El tamaño los fragmentos individuales puede determinarse corriendo un conjunto de fragmentos marcadores de tamaño conocido en otro carril del mismo gel.

21 La transferencia Southern En la transferencia de Southern, el ADN clonado se corta en fragmentos con una o más enzimas de restricción, y estos fragmentos se separan por electroforesis en gel. El ADN se desnaturaliza dentro del gel en fragmentos de cadena sencilla, y éstos se transfieren a un filtro de un material, normalmente nitrocelulosa o un derivado del nailon, que une el DNA. La transferencia se hace colocando la hoja de la membrana encima del gel, y provocando que el tampón pase por el gel y por la hoja de nitrocelulosa o de nailon por capilaridad. El tampón pasa por el gel y por la membrana, arrastrando al DNA fuera del gel e inmovilizándolo en la membrana. Entonces, los fragmentos de DNA del filtro se hibridan con una sonda. Sólo formarán híbridos los fragmentos de DNA de cadena sencilla presentes en la membrana que sean complementarios a la secuencia nucleotídica de la sonda. Se lava la sonda no unida, y se visualizan los fragmentos hibridados. Si se utiliza una sonda radioactiva, la posición de la sonda se determina por autorradiografía, utilizando película fotográfica. Además de para caracterizar ADN clonado, la transferencia de Southern se utiliza para muchos otros fines, como la cartografía de sitios de restricción en un gen o cerca de él, la identificación de fragmentos de DNA que contienen un gen determinado de entre una mezcla de muchos fragmentos, y la identificación de genes relacionados en diferentes especies. También se utiliza para detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermedades genéticas humanas y a cánceres. Existe una técnica de transferencia relacionada que puede utilizarse para determinar si un gen donado es transcripcionalmente activo en un tipo celular o en un tejido dado. Esta técnica detecta la presencia de ARN que sea complementario al segmento de ADN clonado. Como el protocolo original que utiliza ADN unido a un filtro se conoce como transferencia de Southern, el protocolo que utiliza RNA unido al filtro se denomina transferencia northern. Siguiendo esta lógica, otro protocolo en el que se unen proteínas a un filtro se conoce como transferencia western.

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25 6- Secuenciación del ADN La capacidad de determinar directamente la secuencia de nucleótidos de ADN ha sido una aportación magnífica para conocer la estructura de los genes y los mecanismos de la regulación génica. Aunque en la década de los 40 se disponía de técnicas para determinar la composición de bases del DNA, no fue hasta la década de los 60 que se desarrollaron y se utilizaron métodos que proporcionaban el análisis químico directo de la secuencia de nucleótidos. Estos primeros métodos se basaban en los utilizados para determinar la secuencia aminoacídica de las proteínas, y eran lentos y laboriosos. En la década de los 70 se desarrollaron métodos de análisis de la secuencia de nucleótidos más eficientes y directos. Estos métodos se desarrollaron en paralelo a las técnicas de ADN recombinante que permiten el aislamiento de grandes cantidades de segmentos de ADN purificados de cualquier organismo. Los métodos más clásicos son los métodos químicos desarrollados por Allan Maxam y por Walter Gilbert, que corta el ADN en bases específicas, y el desarrollado por Fred Sanger y sus colaboradores, que sintetiza un segmento de ADN que termina en una base determinada. En ambos métodos, el ADN a secuenciar se somete a cuatro reacciones individuales (una para cada base). Los productos de las cuatro reacciones son de fragmentos de ADN cuya longitud difiere en un solo nucleótido. Estos productos de la reacción se separan electroforéticamente en cuatro carriles adyacentes de un gel. Cada banda del gel corresponde a una base, y secuencia del fragmento de DNA puede leerse a partir las bandas del gel. Actualmente se emplean secuenciadotes automáticos que trabajan en tubos con 96 capilares y en los que cada base se determina por reacciones colorimétricas. Con ellos es posible la secuenciación de miles de bases en un solo día.

26 MAXAM Y G I LGERT

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28 SANGER

29 Breve descripción del método automático de secuenciación
La principal diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el método automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción. La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación. El siguiente esquema representa de forma abreviada el método automático de secuenciación.                                                                                                           En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia.                        

30 7- Construcción de bibliotecas de ADN: GENOTECAS Como cada segmento de DNA clonado es relativamente pequeño, deben construirse muchos clones diferentes para incluir todas las pequeñas porciones del genoma de un organismo. El conjunto clonado de todas las secuencias genómicas de un individuo se denomina biblioteca. Las bibliotecas clonadas pueden provenir de un genoma completo, del DNA de un solo cromosoma, o del conjunto de genes transcripcionalmente activos en un único tipo celular.

31 APLICACIÓNS FARNACOLÓXICAS Vacinas recombinantes
Las proteínas inducen la producción de anticuerpos Plásmido híbrido Plásmido híbrido introducido en la célula ADN vírico Proteínas víricas Plásmido bacteriano Virus de la hepatitis B La vacuna produce inmunidad contra la hepatitis B

32 Terapia génica para la deficiencia de ADA
Terapia xénica Terapia génica para la deficiencia de ADA Inserción del gen correcto en el retrovirus Gen correcto ARN vírico El retrovirus infecta las células de la médula ósea obtenidas del paciente Inyección de las células modificadas genéticamente en el paciente

33 Anticuerpos monoclonales
Línea celular mutante derivada de un tumor de linfocitos B Ratón inmunizado con el antígeno X Célula que produce anticuerpo anti-X Hibridoma Solo los hibridomas crecen en el medio selectivo Anticuerpo anti-X secretado Las células se multiplican y se vuelve a evaluar la presencia del anticuerpo anti-X Los clones positivos son fuente continua de anticuerpos anti-X

34 Aplicaciones de la ingeniería genética (en la agricultura)

35 Etapas para la obtención de un organismo transgénico La siguiente tabla resume los pasos básicos de la ingeniería genética empleados para transformar un organismo, y se ejemplifica con un caso concreto: Metodología Caso: obtención de maíz Bt que produce una proteína recombinante que le confiere resistencia a determinados insectos 1. Identificar un carácter deseable en el organismo de origen. 1. Identificar el carácter “resistencia a insectos” en el organismo de origen, la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis (Bt). 2. Encontrar el gen responsable del carácter deseado (gen de interés), aislarlo y caracterizarlo. 2. Encontrar al gen que lleva las instrucciones para esta característica, aislarlo y caracterizarlo. 3. Combinar dicho gen con otros elementos necesarios (vector) para que éste sea funcional en el organismo receptor. 3. Combinar este gen con otros elementos genéticos para que sea funcional en una planta: especialmente una secuencia promotora (y ligarlo a un vector adecuado para transformar plantas) 4. Transferir el gen de interés, previamente introducido en el vector adecuado, al organismo receptor. 4. Transferir este gen a células de maíz (organismo receptor). 5. Crecer y reproducir el organismo receptor, ahora modificado genéticamente. 5. Identificar las células de maíz que recibieron el gen (células transformadas) y regenerar, a partir de estas células, una planta adulta resistente a insectos.

36 Aplicaciones de la ingeniería genética
(en la ganadería mejora características) A las pocas horas de ser fecundados reciben una inyección de ADN Embriones no viables Embriones viables Peces transgénicos. El ADN se ha insertado en el ADN original Peces no transgénicos El cinc de la dieta hace reaccionar al promotor ADN del pez Hormona del crecimiento Crecimiento más rápido Proteína deseada Promotor Gen nuevo Proteína anticongelante Posibilidad de sobrevivir en ambientes más fríos ARN

37 La clonación de seres vivos
Obtención de óvulos Extracción de células mamarias Extracción del núcleo Cultivo de células mamarias Fusión de células Reactivación de genes mediante corriente eléctrica Desarrollo del embrión Implantación del embrión en una tercera oveja Oveja Dolly (clon de la oveja de la que se extrajeron células mamarias)

38 La clonación de seres vivos
Blastocito Células pluripotentes División del cigoto Cigoto Cultivo de células para la obtención de cultivos celulares Célula somática Ovocito enucleado

39 ACTIVIDADE

40 La clonación de seres vivos
ACTIVIDADE La clonación de seres vivos

41 ÉTICA