CA García Sepúlveda MD PhD Transcripción en los Procariotas Laboratorio de Genómica Viral y Humana Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis.

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1 CA García Sepúlveda MD PhD Transcripción en los Procariotas Laboratorio de Genómica Viral y Humana Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

2 2 Transcripción generalidades La transcripción ocurre en las inmediaciones del DNA y requiere de una enzima especial (RNA polimerasa DNA dependiente o DDRP o RNAP). Es regulada por secuencias específicas presentes en el DNA. Genera transcritos de mRNA, tRNA y rRNA. En los procariotas se lleva a cabo en el mismo lugar que la traducción (protoplasma). En los eucariotas el proceso requiere del procesamiento del RNA transcrito para su exportación al sitio de la traducción. El objetivo de la transcripción es EXPRESAR el material genético. Sin expresión no hay función ni evolución.

3 3 La información presente en el DNA se transduce hacia sus efectores (Proteinas o RNA) gracias a un código genético que asegura la integridad y fidelidad (motivo de un tema aparte). Transcripción generalidades

4 4 Unidad transcripcional. Reconocimiento de promotor. Iniciación de la Transcripción. Cadena referencia, la codificante y el RNA. Elongación. Terminación. Prokarya: Transcrito Eukarya: Transcrito primario (pre- mRNA) Transcrito maduro (mRNA)

5 5 Región -35 posee secuencia TTGACA, brinda alta tasa de transcripción. Región -10 posee secencia TATAAT y es esencial (también llamada caja Pribnow y equivalente a caja TATA eucariota). Transcrito inicia en +1. Codon de iniciación downstream de +1. RNAP procariota no requiere de scanning, localiza directamente sobre promotor. Promotores procariotas

6 6 Cadena codificante ATGATGATG Cadena referencia TACTACTAC mRNAAUGAUGAUG Anatomia de los eventos RNAP emplea cadena de referencia (template) para leer en sentido 3’-5’. RNAP escribe en sentido 5’- 3’ (extiende RNA). Uso de helicasas. Pequeña región con una especie hibrida de DNA- RNA. ¿Por que este híbrido no es blanco del silenciamiento? Footprint!

7 7 La transcripción es el proceso mediante el cual una secuencia de DNA es copiada hacia una secuencia de RNA. En procariotas solamente una enzima (RNAP) es empleada para sintetizar las distintas especies de RNA (tRNA, mRNA y rRNA). Los procariotas utilizan distintas enzimas (con sus distintos protomores) para sintetizar las distintas especies de RNA. Principal transcriptasa es diferente a la primasa. Existen tres etapas al proceso de transcripción: Iniciación, Elongación y Terminación. Transcripción procariota

8 8 La transcripción es el proceso mediante el cual una secuencia de DNA es copiada hacia una secuencia de RNA. En procariotas solamente una enzima (RNAP) es empleada para sintetizar las distintas especies de RNA (tRNA, mRNA y rRNA). Los procariotas utilizan distintas enzimas (con sus distintos protomores) para sintetizar las distintas especies de RNA. Principal transcriptasa es diferente a la primasa. Existen tres etapas al proceso de transcripción: Iniciación, Elongación y Terminación. Transcripción procariota

9 9 La transcripción es el proceso mediante el cual una secuencia de DNA es copiada hacia una secuencia de RNA. En procariotas solamente una enzima (RNAP) es empleada para sintetizar las distintas especies de RNA (tRNA, mRNA y rRNA). Los procariotas utilizan distintas enzimas (con sus distintos protomores) para sintetizar las distintas especies de RNA. Principal transcriptasa es diferente a la primasa. Existen tres etapas al proceso de transcripción: Iniciación, Elongación y Terminación. Transcripción procariota

10 10 La transcripción es regulada durante la iniciación (Si, No, que tanto). En las bacterias inicia con la unión de la RNAP (Subunidad σ) al DNA en el promotor (región -35 y -10). Aproximadamente 12 bp se desnaturalizan para darle acceso a la RNAP. Burbuja transcripciional (= a ojo replicacional) se extiende a 18 bp para dar inicio a la transcripción. Subunidad σ es liberada y otros factores de elongación son reclutados al sitio. Transcripción procariota

11 11 La transcripción es regulada durante la iniciación (Si, No, que tanto). En las bacterias inicia con la unión de la RNAP (Subunidad σ) al DNA en el promotor (región -35 y -10). Aproximadamente 12 bp se desnaturalizan para darle acceso a la RNAP. Burbuja transcripciional se extiende a 18 bp para dar inicio a la transcripción. Subunidad σ es liberada y otros factores de elongación son reclutados al sitio (NusA). Transcripción procariota

12 12 Nucleotidil transferasa. En 1959 el premio Nobel fue para Arthur Kornberg por lo que entonces se creia era RNAP (en realidad otra enzima). Finalmente descubierta por Sam Weiss, Audrey Stevens y Jerard Hurwitz en 1960. Roger Kornberg (hijo) fotografio con ME a la RNAP en acción. RNA polimerasa procariota (RNAP o RNApol)

13 13 Holoenzima consta de 5 subunidades (aprox 400 kDa). α = hay dos, andamiaje enzimatico y ensamblaje de la holoenzima. β = Principal subunidad catalítica (polimerasa) durante iniciación y elongación. β’= Permite unión inespecífica al DNA (estado reposo) con poca afinidad para permitir su liberación rápida. σ = Subunidad polimórfica que brinda la especificidad por el promotor. RNA polimerasa procariota (RNAP o RNApol)

14 14 Dos modelos de control de la expresión procariota: Negativos Operón inducible – lac Operón represible - Tryp Positivos CRP Regulación de la transcripción en procariotas

15 15 Normalmente la bacteria emplea glucosa como energético. A falta de glucosa requiere de mecanismo alterno para el aprovechamiento de carbohidratos. En presencia de Lactosa seria conveniente aprovecharla como fuente de energia. Lactosa = β-D-galactosa & β-D-glucosa. Necesita: Transportador que permita entrada de lactosa Enzima que digiera lactosa Enzima que ayude a digerir lactosa (transfiriendo Acetilo) En presencia de glucosa no es necesario gastar tanta energia para el aprovechamiento de la lactosa! Operón lac

16 16 Operón inducible - normalmente apagado (reprimido) en ausencia del inductor (lactosa). Bacteria solamente requiere del operón lac en presencia de Lactosa... por ende, el operón se encuentra apagado cuando no hay lactosa (reprimido) y encendido cuando si la hay... La lactosa se une al represor y evita que interactue con el operador y apague (reprima) al operon. Operón lac

17 17 Si hay lactosa se transcriben los tres genes contiguos del operón lac: lacZ (enzima que digiere la lactosa) lacY (transportador de lactosa), y lacA (el auxiliar) Operón lac

18 18 Enzima catalítica que hidroliza a los ß-galactósidos hacia monosacáridos. Operón lac Si hay lactosa se transcriben los tres genes contiguos del operón lac: lacZ (enzima que digiere la lactosa) lacY (transportador de lactosa), y lacA (el auxiliar)

19 19 Transportador que permite el ingreso de la lactosa. Operón lac Si hay lactosa se transcriben los tres genes contiguos del operón lac: lacZ (enzima que digiere la lactosa) lacY (transportador de lactosa), y lacA (el auxiliar)

20 20 Conenzima que auxilia en la digestión de la lactosa (transfiriendo un grupo acetilo) Operón lac Si hay lactosa se transcriben los tres genes contiguos del operón lac: lacZ (enzima que digiere la lactosa) lacY (transportador de lactosa), y lacA (el auxiliar)

21 21 Operón lac La bacteria supera la inanición de glucosa aprovechando la energia alternativa brindada por la lactosa... Todos felices.

22 22 No obstante, en ausencia de lactosa no hay por que mantener este sistema energéticamente costoso encendido... No servirá de nada. Lactosa no se une al represor, el cual se puede unir al operador y reprimir al operón. Operón lac

23 23 cAMP normalmente bajo cuando glucosa está presente como la principal fuente de carbono. cAMP aumenta al faltar la glucosa. cAMP se une al cAMP receptor protein (CRP) activándolo. cAMP-CRP activo se une al sitio CRP del operón lac y activa la transcripción de los genes lac. Regulación Positiva por CRP-cAMP

24 24 Ejercicio - Operón de la lactosa

25 25 Ejercicio - Operón de la lactosa

26 26 Ejercicio - Operón de la lactosa

27 27 Ejercicio - Operón de la lactosa

28 28 Ejercicio - Operón de la lactosa

29 29 Operón reprimible – Molécula represora únicamente se une a operador cuando existe inductor. Las bacterias requieren del aminoácido para su crecimiento, lo aporte o nó el medio en que vive. Cuando hay trp en el medio, la bacteria apaga al operón que fabrica trp, el mismo trp incementa la afinidad del represor por el operador (secuencia de DNA). Operón del triptófano

30 30 Triptofano se une a represor. Complejo triptofano-represor se unen a operador. RNA pol incapaz de transcribir genes trpE a trpA Operón del triptófano

31 31 En ausencia de Trp, el represor nunca se une a operador ni puede bloquear el paso de la RNA pol. RNA pol transcribe genes trpE a trpA Operón del triptófano

32 32 Estos genes le permiten a la bacteria sintetizar Trp ella misma sin depender del suministro ambiental. Operón del triptófano

33 33 Dos mecanismos de terminación descritos: Rho dependiente, y Rho-independiente La terminación prematura de la transcripción (atenuación) tiene función regulatoria también. Para incrementar la complejidad (y el estrés de los estudiantes) la transcripción también puede regularse por anti-terminacion... Terminación de la transcripción procariota

34 34 Rho-dependiente RNA pol pasa codon de terminación en DNA. Después del TER se topa con una secuencia específica: Rho-Binding Site Proteina Rho reconoce esta región y se une a ella (proceso que requiere de ATP). Unión de Rho a mRNA “libera” al transcrito y detiene la transcripción. Terminación de la transcripción procariota

35 35 Rho-independiente Después de transcribir y pasar el TER se topa con una secuencia especial. A- Palindromo rico en repeticiones invertidas “GGGG=CCCC” que forma estructura “hairpin” secundaria. B- La secencia palidromica es seguida (en el transcrito primario) por región Poly-U. Ambos elementos bastan para determinar la liberación del transcrito primario y el final de la transcripción. Terminación de la transcripción procariota

36 36 rRNA y tRNA bastante estables bajo condiciones normales. mRNA poco estable bajo condiciones normales (t½ <1 min)‏ Esta vida media corta tiene relevancia funcional... Es aprovechada por los procariotas para responder rápidamente a las exigencias ambientales. Cualquier molécula (transcrito) de RNA es vulnerable a la degradación Cuando se encuentra desnudo (no asociado a proteinas). Cuando no ha sido modificado (Cap 5’ y poliadenilado en 3’). Cuando permanece en forma de ssRNA en vez de conform dsRNA. Labilidad del RNA

37 37 rRNA es procesado (modificado) por diferentes enzimas (>10 para 16S y >13 para 23S, procariotas) para estabilizar su estructura. RNA Proteinas rRNA también es estabilizado por proteinas. No obstante, en algunas situaciones el rRNA también es degradado rápidamente (depleción de Mg ++ ). Labilidad del RNA

38 38 tRNA adopta estructura dsRNA que lo estabiliza. tRNA es sometido a procesamiento postranscripcional que modifica el contenido de bases y estabiliza su estructura. Labilidad del RNA

39 39 En los procariotas, la transcripción se encuentra acoplada a la traducción. Los ribosomas se unen al mRNA y comienzan a traducirlo a aminoácidos tan pronto como comienza a ser transcrito. Mecanismo optimizado para aprovechamiento de recursos (concordante con filosofia simplista). La regulación de cualquiera de estos dos procesos afecta al otro. Acoplamiento transcripto-traduccional procariota

40 40 Los genes procariotas son mono-exónicos pero poli-cistrónicos. Transcripción de varios genes al mismo tiempo. Un mRNA codifica para varios polipeptidos. Peptidos individuales liberados por codones de terminación en ribosoma. Transcripción procariota