Metabolismo del nitrógeno: Acidos nucleicos y Síntesis de Proteínas Dra. María Irene Balbín Arias Dr. Ramiro Valdés Carmenate Dpto. Química, Fac. de Agronomía UNAH

ANTECEDENTES 1953. - Sanger estableció la estructura completa de una proteína: la Insulina. - Crick y Watson demostraron que el DNA tenía una estructura de doble hélice. 1963. Nirenberg descifró la clave genética cuya generalidad se aplicaba desde la bacteria hasta el hombre. 1967. Edman y Begg establecieron métodos de degradación de proteínas. (Estructura primaria). 1978. Dayhoff y Eck establecieron las estructuras primarias de más de 500 proteínas (Atlas de proteínas).

ANTECEDENTES 1976-1981. Gilbert y Maxan elaboraron un método rápido de análisis del DNA. 1981. Gilbert determinó la secuencia de más de 1 000 nucleótidos/semana y con un solo operador. 1981. Alvarado-Urbina y otros, lograron sintetizar en solo tres días un gen con una máquina. Se pudo conocer el papel que desempeña una secuencia particular de nucleótidos en la regulación de la síntesis del RNA y por lo tanto de una proteína.

DNA RNA PROTEÍNAS Dogma central de la genética molecular Replicación Transcripción RNA Traducción PROTEÍNAS

ESTRUCTURA DEL ADN (Polinucleótido) (Consultar libro electrónico de Acidos nucleicos) Enlaces fosfodiésteres

ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL ADN Pares de base complementarias

REPLICACIÓN El DNA presente en los cromosomas de los organismos vivos debe ser duplicado durante la división celular para asegurar que cada núcleo descendiente reciba la información genética completa. La síntesis de las moléculas de DNA se conoce como proceso de replicación. Este proceso se divide en tres fases: inicio, elongación y terminación.

Este proceso se denomina entonces replicación semiconservadora. Las fases se distinguen por las reacciones que tienen lugar y por las enzimas que se requieren. Cada cadena de DNA en la doble hélice actúa como un patrón (molde) sobre el cual nuevas cadenas complementarias son sintetizadas. La replicación del DNA da lugar a dos moléculas "hijas" idénticas a la molécula progenitora del DNA pero cada una de ellas contiene una cadena intacta de su molécula progenitora y una nuevamente sintetizada. Este proceso se denomina entonces replicación semiconservadora.

¿Cómo ocurrirá este proceso? ¿Se desenrrollarán totalmente las cadenas del original (DNA) parental antes de que sea replicada?. ¿Empezará la replicación en sitios al azar o en punto único?.  Después de iniciada la replicación en un punto del DNA, ¿transcurrirá en una dirección o en ambas?.

La reacción empieza en una secuencia del DNA denominada origen, a partir del cual se comienzan a separar las cadenas de la doble hélice formándose lo que se denominan horquillas de replicación que es donde se desenrolla el DNA parental y las cadenas separadas comienzan a replicarse rápidamente y generalmente en forma bidireccional. Origen de replicación Cadenas hijas formadas ADN parental o madre

Enzimas que participan DNA helicasa: Se trasladan a lo largo del DNA y van separando las dos cadenas utilizando la energía química del ATP (la separación de cada par de bases involucra un gasto de dos moléculas de ATP). La separación de las cadenas crea una tensión topológica en la estructura helicoidal del DNA que se elimina por la acción de las topoisomerasas, enzimas que aumentan o disminuyen el grado de enrrollamiento del DNA haciendo variar el número de enlace. Las cadenas de DNA separadas son estabilizadas por interacción con algunas proteínas denominadas de fijación al DNA monohebra (SSBP) (single‑stranded DNA binding proteins), conocidas como factor de replicación (RF).

Enzimas que participan DNA polimerasas: Cataliza la formación de una nueva cadena de DNA bajo la dirección de una cadena simple que sirve como molde e incluye la unión de desoxiribonucleótidos. La ecuación general de la reacción catalizada por la DNA polimerasa será:   (dNMP)n + dNTP ‑‑‑‑‑‑ (dNMP)n+1 + PPi DNA molde DNA alargado donde dNMP = desoxinucleósido 5'‑monofosfato dNTP = desoxinucleósido 5‑trifosfato.

REPLICACIÓN DNA Polimerasa Requiere de un molde Requiere de un cebador Cataliza la síntesis en dirección 5’ 3’ Posee actividad exonucleasa 3’ 5’ Actividad correctora de pruebas Posee actividad exonucleasa 5’ 3’ Actividad de reparación del DNA

Esquema del proceso de Replicación Cadena nueva Acople DNA polimerasa Molde de la cadena continua Helicasa Horquilla de replicación DNA parental Replicación del ADN LIgasa Polimerasa I Fragmento de Okasaki Primasa ARN primer Proteínas ligadas a ADN de cadena simple Molde de la cadena rezagada

Veamos cómo se produce este proceso

TRANSCRIPCIÓN Formación de moléculas de RNA a partir de la información contenida permanentemente en el DNA. En este proceso, un sistema enzimático convierte la información genética de un segmento de DNA en una cadena de RNA, con una secuencia de bases complementaria a una de las cadenas de DNA. Es muy similar a la replicación en términos de mecanismo químico, polaridad (dirección de la síntesis) y utilización de un molde. El inicio de la síntesis tiene lugar en secuencias específicas llamadas promotores que dirigen la transcripción de segmentos adyacentes de DNA (genes).

Enzimas que participan donde NMP = nucleósido 5'‑monofosfato La enzima capaz de formar un polímero de RNA a partir de ribonucleósido 5'‑trifosfatos, la RNA polimerasa dirigida por DNA, fue aislada a partir de extractos bacterianos en 1959. Requiere los cuatro ribonucleósidos 5'‑trifosfatos (ATP, GTP, UTP y CTP) como precursores de las unidades nucleotídicas del RNA, así como Mg2+ y también contiene Zn2+. La ecuación general de la reacción catalizada por la DNA polimerasa será:   (NMP)n + NTP ‑‑‑‑‑‑ (NMP)n+1 + PPi RNA RNA alargado donde NMP = nucleósido 5'‑monofosfato

TRANSCRIPCIÓN RNA Polimerasa Requiere de un molde No se copia el cromosoma entero NO requiere cebador SOLO UNA DE LAS CADENAS ACTUA COMO MOLDE Cataliza la síntesis en dirección 5’ 3’ NO posee actividad exonucleasa 3’ 5’ Actividad correctora de pruebas NO posee actividad exonucleasa 5’ 3’ Actividad de reparación del DNA

Veamos cómo se desarrolla la transcripción Una de las dos hebras de la doble cadena del DNA, se desenrolla en una corta distancia formando una "burbuja" de transcripción. En estos casos también actúan las topoisomerasas aliviando los problemas topológicos causados por la transcripción. Una de las dos cadenas sirve de molde para la síntesis del RNA, la otra es la llamada hebra complementaria al molde. La síntesis del RNA empieza normalmente con un residuo GTP o ATP, cuyo grupo 5'‑trifosfato no es cortado para liberar pirofosfato (PPi) sino que se mantiene intacto durante toda la transcripción. La nueva cadena de RNA forma temporalmente apareamiento de bases con el DNA molde formando una doble hélice de un híbrido RNA‑DNA corto que es esencial para la lectura correcta de la hebra de DNA.

Esquema del proceso de Transcripción Sitio de terminación de la transcripción Sitio de inicio de la transcripción RNA polimerasa

TRADUCCIÓN: Síntesis de proteínas Requiere: Más de 70 proteínas ribosómicas diferentes. 20 o más enzimas para activar los aminoácidos precursores. Una docena o más de enzimas auxiliares. Otros factores específicos para el Inicio, Elongación y Terminación. Aproximadamente 100 enzimas adicionales para la modificación de las diferentes clases de proteínas. 40 o más clases de RNA de transferencia y ribisómicos. Cooperan más de 300 macromoléculas diferentes

Expresión genética

La síntesis de las proteínas se lleva a cabo en los Descubrimientos importantes de la década del 50 La síntesis de las proteínas se lleva a cabo en los ribosomas. 2. Los aminoácidos se unen a una forma de RNA termoestable, los tRNA, formando aminoacil-tRNA, proceso catalizado por las aminoacil-tRNA sintetasas. PAPEL ADAPTADOR 3. De qué modo se traduce la información genética contenida en el lenguaje de 4 letras de los AN al lenguaje de 20 letras de las proteínas. CÓDIGO GENÉTICO

Código genético Conjunto de palabras codificadas en forma de tripletes en el DNA (ó mRNA) que codifica los aminoácidos de las proteínas. En los años 60 ya se conocía que para codificar cada aminoácido se requieren al menos tres residuos de nucleótidos. El código de 4 letras del DNA (A,T,G y C) en grupos de dos, sólo pueden dar 42 = 16 combinaciones diferentes que no son suficientes para codificar los 20 aminoácidos. Sin embargo, 4 bases en grupos de tres pueden dar 43 = 64 combinaciones diferentes.

Código genético

Fase 1. Activación del aminoácido. Etapas de la Síntesis de proteínas Fase 1. Activación del aminoácido. Fase 2. Inicio de la síntesis. Fase 3. Elongación de la cadena polipeptídica. Fase 4. Terminación y liberación. Fase 5. Plegamiento y maduración.

Fase 1. Activación del aminoácido. Esterificación de los 20 aminoácidos diferentes que componen las proteínas con sus correspondientes tRNA por medo de las enzimas aminoacil‑tRNA sintetasas, cada una de las cuales es específica para un aminoácido y uno o más tRNA correspondientes. Reacción global catalizada por las aminoacil‑tRNA sintetasas Mg2+ Aminoácido + tRNA +ATP ‑‑‑‑aminoacil‑tRNA + AMP + PPi Objetivos de la aminoacilación del tRNA Activación de un aminoácido para formar un enlace peptídico. Unión del aminoácido a un tRNA adaptador que dirige su colocación dentro de un polipéptido en crecimiento.

Complejo de inicio de la Traslación tARN cargado con metionina Codón de inicio AUG ARN mensajero Subunidad ribosomal pequeña grande Esquema general de la traducción

Fase 2. Inicio de la síntesis. Requiere 1) La presencia de una subunidad ribosomal pequeña 30S que se enlaza a la señal iniciadora en el mRNA.  2) El mRNA para codificar el polipéptido. 3) Un aminoacil‑tRNA iniciador, que en organismos procarióticos es el formilmetionil‑tRNA [fmet;i] (donde fmet e i indican que el tRNA involucrado es específico para la iniciación con formilMetionina). 4) Un número de factores de iniciación IF. 5) El trinucleótido, GTP. 6) La subunidad ribosomal 50S.

Codón de inicio INICIO

Fase 3. Elongación de la cadena. Requiere GTP Complejo de iniciación (ribosoma funcional 70S). Siguiente aminoacil‑tRNA especificado por el próximo codón en el mRNA. Tres proteínas solubles denominadas factores de elongación. Enzima peptidil transferasa que cataliza la formación del enlace peptídico. Se corresponde con el rRNA 23S, una de las proteínas asociada a la subunidad ribosomal grande denominado ribozima.

ELONGACIÓN Las cadenas polipeptídicas comienzan siempre por el grupo amino terminal y se elongan por adiciones sucesivas de aminoácidos al grupo carboxilo terminal.

Fase 4. Terminación y liberación. Ocurre cuando el sitio A del ribosoma contacta con uno de los tres codones de terminación posible (UAA, UAG, UGA). Tres factores de liberación hidrolizan al polipéptido desde el tRNA terminal liberándolos al citoplasma y también catalizan la disociación del ribosoma en las subunidades.

Codón de terminación también UAG y UGA TERMINACIÓN

Energía requerida para la síntesis de las proteínas   Activación del aminoácido: 1ATP y 5 enlaces fosfato de alta energía   Iniciación 1GTP Elongación de cadena 2 GTP Corrección de prueba por aminoacil‑tRNA sintetasa 1 ATP por cada aminoácido que entre equivocado.

Fase 5. Plegamiento y maduración. Modificaciones postraslacionales para hacerlas activas Metilación de algunos residuos de aminoácidos como la Lisina Glicoproteínas. El componente glicosil se añade después de que la cadena polipeptídica ya se ha sintetizado. Pueden ser: azúcares como pentosas (xilosa y arabinosa) y hexosas (manosa, glucosa, galactosa) o hexosaminas (N‑acetilglucosamina y N‑acetilgalactosamina). Grupos prostéticos. Son necesarios para la actividad de algunas enzimas. Un ejemplo de ello es el cit.c, que tiene un grupo hemo, el cual es añadido a la cadena polipeptídica después de la traslación. Polipéptidos señales. Secuencias cortas, liberadas desde el polipéptido en crecimiento por la acción de peptidasas señales asociadas a la membrana del Retículo Endoplasmático. Trasladan la proteína hasta su lugar de acción.

Síntesis simultánea de proteínas en los poliribosomas Ribosomas en traslación múltiple Polipéptido terminado en formación mARN Polisomas Síntesis simultánea de proteínas en los poliribosomas Así se logra una mayor eficiencia en este proceso

Bibliografía empleada Principles of Biochemistry. Lehninger, 2001. (Libro electrónico) Principios de Bioquímica. Lehninger, A.; Nelson D.; Cox, M., Ed. Omega, 1993. Elementos de Bioquímica General. Valdés , R.; María I. Balbín. UNAH, Cuba, 1999.