Convirtiendo lecturas de secuencia en un mapa de secuencia Scaffolds o supercontigs: el reto consiste en “pegar” los miles de contigs producidos por el WGS.

Lectura promedio de 600 bp Genoma de 3,000’000,000 Necesitamos 50 millones de lecturas independientes para obtener una cobertura 10X Tasa de falla: 20% Minimizar el esfuerzo y error: automatizacion

Estrategias de secuenciamiento Whole genome shotgun Map based Ambas estan basadas en la produccion de clones

Shotgun sequencing Inserto es desconocido Pair-end reads Los primers son secuencia del vector

Scaffolds o supercontigs: La solucion esta en usar los pair-end Reads teniendo insertos de varios tamaños: 2kb, 100kb y 150kb

Este metodo se uso en cientos de procariotas (112 en julio del 2003) Tambien en Drosophila la cual tiene repeats largos (3-8kb) cada 150kb

Usando el metodo de clones ordenados para secuenciar genomas complejos Los clones de una genoteca son evaluados para buscar similaridades en patrones de restriccion. El resultado son grupos de clones ordenados u orientados a lo largo del genoma que se llama el mapa fisico. Luego cada clon es tratado como un minigenoma en el cual se producen muchas lecturas para cada uno usando la logica del WGS Finalmente las secuencias son ensambladas en una secuencia llamada consenso

Digestion con multiples enzimas para generar el fingerprint de cada clon. Lo importante es el numero de bandas que son compartidas. 25-50% de bandas para tenr un overlap

El mapa fisico ensambla los clones en grupos que se sobrelapan llamados contigs de clones. Eventualmente cada contig sera del Largo de un cromosoma

Gaps En ambos metodos de secuenciamiento existen zonas con “gaps” Secuencias que incapacitan a la bacteria para crecer. Si los gaps son cortos: PCR y primer walking Si son grandes clonar en un organismo diferente, ej. Levaduras.

Uniendo mapas fisicos con mapas geneticos y citogeneticos Los probes pueden ser hibridizados a los clones. Las secuencias de los marcadores pueden ser buscadas en los clones usando computadoras (electronic PCR)

Clonamiento posicional

El significado de la secuencia La informacion en el genoma puede ser descrita como la totalidad de secuencias que codifica las proteinas, RNA y los docking sites que Permiten la accion de estos a tiempo y en tejido apropiado.

Deducir los genes que codifican proteinas (proteoma) Buscar ORFs computacionalmente encontrando start y stop codons Evidencia directa de cDNAs y ESTs

Docking sites Gene finding programs Buscan predecir secuencias sitios de inicio de la transcripcion, splice sites, codones de inicio de la traduccion Estas predicciones estan basadas en estadisticas de los motivos consenso No son perfectos

Prediciendo genes UGC vs UGU Para cysteine Diversas informaciones independientes se validan

Genomica funcional