Caracterización y valor pronóstico de la expresión de c-Myb y B-Myb en Leucemia Mieloblástica Aguda Laboratorio de Biología Molecular Hospital La Fe

B-Myb y c-Myb Pertenecen a una familia de factores de trascripción  A-Myb Gónadas  B-Myb Ubicuo  c-Myb C.Hematoyéticas Es un gen que pertenece , en el que están englobados el amib, bmyb y cmyb Implicado en proliferacion celular, diferenciacion celular y apoptosis Regulan la expresión de gran número de proteíans

B-Myb Progenitor Ancestral Unión-DNA Trans-activación Regulación B-Myb progenitor ancestral c-Myb y A-Myb se originaron por duplicación durante la evolución

B-Myb y c-Myb Cromosoma 20 Cromosoma 6 c-Myb 6q23 B-Myb 20q13

etapa temprana in utero Myb en Ratones Ratones homocigotos A-Myb inactivado Viables C-Myb inactivado Muerte etapa tardía in utero Fallo hematopoyesis (anemia severa) B-Myb inactivado Muerte etapa temprana in utero Todos los miembros de la familia mantienen unos dominios regulatorios y de trans-activación altamente conservados. Se ha descrito que de los tres miembros de la familia Myb presentes en vertebrados, B-Myb seria el ortólogo o progenitor ancestral y que los otros dos miembros se originaron por duplicación durante la evolución. En invertebrados, hay un único gen Myb, que presenta gran homología con B-Myb. Esta homología, no es solo a nivel de secuencia sino también funcional. De esta forma, se ha visto que el fenotipo letal de los mutantes de Drosophila Myb se puede rescatar con B-Myb de vertebrados por ensayos de complementación. Este rescate de fenotipo no es posible con los otros dos miembros de la familia (A-Myb y c-myb) (4,5). B-MYB knockout mice die at E4.5-E6.5 due to early developmental arrest. Existen estudios experimentales que demuestran que los ratones homocigotos con B-Myb inactivado mueren en una etapa temprana del desarrollo embrionario (5), los ratones con c-Myb inactivado también mueren in utero pero en una etapa tardía del desarrollo embrionario debido a un fallo en la hematopoyesis fetal, concretamente debido a una anemia severa por una hematopoyesis ineficaz que afecta a todas las líneas (6). Mientras que los ratones con A-Myb inactivado son viables (3). 5

Necesaria para función celular B-Myb y c-Myb “Correcta expresión” Necesaria para función celular La sobrexpresión de B-Myb favorece el desarrollo tumoral y progresión del ciclo celular, por lo que podría tener un papel como oncogén. La infraexpresión de B-Myb produce arresto en mitosis y condensación cromosómica por lo que también podría actuar como gen supresor de tumores. En cuanto a c-Myb, su expresión es elevada en las células primitivas hematopoyéticas favoreciendo su proliferación. Por otro lado la expresión reducida de c-Myb es necesasria para la diferenciación terminal. Todos estos hallazgos hacen suponer que para mantener una función celular normal es necesaria una correcta expresión de ambos genes. Por tanto su desregulación podría favorecer el desarrollo neoplásico. Desregulación ¿Desarrollo tumoral?

Objetivos En Pacientes con LMA: 1.-Cuantificación expresión de B-Myb y c-Myb 2.-Asociación expresión de B-Myb y c-Myb - factores clínico-biológicos 3.- Valor pronóstico de B-Myb y c-Myb

Pacientes I 197 Leucemias Mieloblásticas Agudas

Pacientes II 197 Leucemias Mieloblásticas Agudas

Métodos Cuantificación Relativa de la expresión de B-Myb y c- Myb mRNA obtenido de MO cDNA TaqMan Expression Assay para B-Myb y c-Myb B-Myb Gus Cuantificación Relativa (δδCt= δCtmuestra- δCtcalibrador ) Calibrador: Niveles CD34+ Muestras: Pacientes LMA

Expresión respecto CD34+ Resultados Expresión respecto CD34+ c-Myb 0,26 (0,01-4,27) B-Myb 2,46 (0,08-39,79) c- Myb B-Myb P=0,001

Resultados c-Myb -Factores clinico-biológicos Niveles de c-Myb reducidos : mieloproliferación con aumento de trombopoyesis The Embo journal 2009

Resultados B-Myb- Factores clinico-biológicos Niveles de B-Myb elevados: Asociación de con otros tumores: Neuroblastoma, mama, próstata Malignidad Cancer Research 1999, Eur J cancer 2005

Valor Pronóstico de las LMA no M3 Resultados Valor Pronóstico de las LMA no M3 Expresión de c-Myb p=0,855 Expresión de B-Myb p=0,109

Valor Pronóstico de las LMA no M3 Resultados Valor Pronóstico de las LMA no M3 c-Myb B-Myb ≤ Mediana (n=44) ≤ Mediana (n=39) > Mediana (n=36) > Mediana (n=41)

Valor Pronóstico de las LMA no M3 Resultados Valor Pronóstico de las LMA no M3 ANÁLISIS MULTIVARIANTE p HR IC 95% Expresión B-Myb 0,039 2,33 (1,04-5,22) Edad (≤ 60 años) 0,02 3,47 (1,57-7,77) ANÁLISIS MULTIVARIANTE p HR IC 95% Expresión B-Myb 0,043 3,24 (1,04-10,13)

MECANISMOS MODIFICADORES DE LA ACTIVIDAD DE B-Myb La disminución de c-Myb produce mieloproliferación, de manera que se produce una reducción de la diferenciación eritroide y granulocítica y aumento de la trombopoyesis.

1. miRNA

miRNA

miRNA

miRNA Western n=80 Expresión 16 15b 30a 30b 30c 30d 30e 29a 29b 29c

CD34 Obtención de células CD34+ de sangre de cordón

MIMICS & INHIBITORS

2. POLIMORFISMO S427G Se ha demostrado que el cambio del aminoácido altera la estructura de la proteína de manera que inactive la función de B-Myb

POLIMORFISMO S427G PCR Tiempo Real con sondas hibridación Puesta a punto con sondas hibridación Grupo control n=46 analizados Homocigotos n=2 Wild type n=35 Se ha demostrado que el cambio del aminoácido altera la estructura de la proteína de manera que inactive la función de B-Myb Heterocigotos n=2

3. VARIACIONES GENÉTICAS HRM región codificante 14 exones Puesta a punto exones: 2, 3, 4, 5, 6, 9,12,14 Mutado

4. ALTERACIONES GENÓMICAS c-Myb: FISH n=35 2 pacientes con trisomia en el cromosoma 6 (+6) EXP: 0.04 y 0.24

ALTERACIONES GENÓMICAS B-Myb: FISH RP11-354E16 RP11-69I10 Deleciones b-MYB RP11-822E15* RP11-464F7 Traslocaciones n=7 1 paciente con trisomia en el cromosoma 20 (+20) 3 pacientes con monosomía en el 20 (-20) EXP: 6.45 EXP: 0.96, 8.31 y 2.03