Purificación de α - Lacta-albúmina JA Carde, PhD Modificado de Dra. Liza Jiménez UPR-Ag Lab Biol 4019 Purificación de α - Lacta-albúmina

Objetivos Describir los diferentes métodos para extraer proteínas de una fuente particular. Explicar los factores importantes para mantener las proteínas en ambientes artificiales estables. Distinguir los agentes utilizados para precipitar las proteínas y explicar sus mecanismos de acción. Extraer y purificar la proteína alfa-Lactalbumina utilizando el método de precipitación por sales.

Introducción Laboratorios de Bioquímica y la Biología Celular y Molecular requieren en algún momento, la extracción, purificación y caracterización de una o varias proteínas. El mejor procedimiento para purificar una proteína es aquel que produce la cantidad máxima de proteína en el tiempo mínimo posible.    

Métodos de romper la célula lísis osmótica: se colocan las células en una solución con alta fuerza iónica y luego se transfieren a agua pura homogenizador: un tubo de cristal con un pequeño mortero ondas ultrasónicas, producidas por un sonicador lisoenzimas, licuadoras

Métodos: homogenizador

Estabilidad de las proteínas: factores importantes alta fuerza iónica, lo que se debe a la presencia de sales pH, amortiguadores celulares, naturales presencia de iones metálicos:Na+, K+, Ca+2, Mg2+ y Fe3+ aumentan la estabilidad de la proteína; Ag+, Cu2+, Pb2+ y Hg2+ son perjudiciales para aquellas proteínas con sulfidrilos en su estructura. proteasas que hidrolizan los enlaces péptidos de las proteínas. temperaturas bajas (0-4 ºC). Ionic Strength  Proteins are usually more soluble in dilute salt solutions than in pure water. The salts are thought to associate with oppositely charge groups in the protein. This combination of charged groups bonds more water than do the charged groups alone and protein hydration is increased. With most proteins there is little change in solubility as more salt is added until some very high salt content is reached. At very high levels of salt there is a competition between the ions and the proteins for water of hydration. Bajo pH – se pone toda +, se repelen no se agregan Subes pH – se pone toda -, se repelen no se agregan Areas extensas la repulsion INTRAMOLECULAR es tanta que Se abre la proteina y se expone grupos hidrofobicos, se agregan se pptan When the salt concentration is high enough, the proteins will be sufficiently dehydrated to lose solubility. Removal of the salt or dilution to a low enough concentration will usually result in the recovery of native structure.

Solubilidad Lo que interrumpa la interacción entre la proteína y el agua, disminuye su solubilidad El agregado formado por las moléculas de proteína se precipita de la solución Factores que afectan solubilidad o facilitan la precipitación: concentración de las sales inorgánicas el pH la temperatura.

Concentración de sales: “Salting Out” Sulfato de amonio una de las sales más utilizadas para precipitar proteínas. Cuando se añade la sal, la concentración alcanza un punto donde no deja presente agua suficiente para interactuar con la proteína y mantenerla en en solución. Esto promueve que esa proteína se precipite (“salted out”) de la solución. Distintas concentraciones de sales para distitnas proteinas!!

“Salting Out” Puentes de H entre agua y AA de la proteinas…

pH – punto isoeléctrico Un cambio en el pH de la solución altera el estado iónico de la proteína Las proteínas con cargas se repelen unas a otras lo que las mantiene solubles en agua. Las proteínas neutrales no se repelen unas a otras por lo que tienden a agregarse y precipitarse o “salirse” de la solución. Cada una de ellas posee un punto isoeléctrico específico. Una proteína, cuando es isoeléctrica?

pH – punto isoeléctrico

Temperatura Aumento en temperatura mayor la solubilidad de la proteína (en la mayoría de las proteínas hasta que alcanzan 40 ºC). Sobre esta temperatura la mayoría de ellas se agregan y se precipitan de la solución. Algunas proteínas son estables a temperaturas sobre 40 ºC. Estas pueden ser purificadas y separadas de las proteínas que se precipitan a 40 ºC por medio de centrifugación.    Porque sobre 40 pierden solubilidad? Se rompen enlaces debiles como los de H.. Comienzan a denaturarse Se exponen los hidrofobicos y menos soluble es Hasta e llimite de 40 puede romper y renaturar Mas de 40 no hay vuelta atras

Purificación La técnica de precipitación por sales es fácil pero posee varias desventajas. 1) las proteínas estarán contaminadas con las sales utilizadas 2) las proteínas estarán contaminadas con otras proteínas de mayor peso molecular. PLT La precipitación por sales debe ser acompañada (seguida) de diálisis y/o cromatografía.  

Diálisis La diálisis es un metodo de separación basado en difusión que se realiza para remover moléculas pequeñas como iones de amonio y sulfato (sales). La proteína aislada es resuspendida en agua o solución amortiguadora y colocada en una bolsa de celofán. Esta bolsa se coloca en agua o solución amortiguadora, los iones de sal se salen La solución amortiguadora es cambiada cada cierto tiempo y el proceso continúa Se realiza a 4 ºC para minimizar la contaminación con bacterias. EDTA: agente quelante

α Lacta-albúmina Una de las proteínas presentes en la leche a una concentración de 1 mg/ml.   Se purificó por primera vez en 1899; peso molecular de 15,000 da y contiene 129 amino ácidos. componente esencial en la síntesis de lactosa.   caseínas : proteínas principales en la leche se pueden remover de la leche a través de precipitación ácida a un pH de 4.6, por calor o utilizando sulfato de sodio.   La Lactalbumina se mantiene soluble en el medio después de cualquiera de estos tratamientos. caracterizar : determinar si la proteína obtenida es la deseada, mediante pruebas donde se determine las propiedades físicas, químicas o biológicas de la proteína. Ej: PI, PM. Contenido de AA

Protocolo Coloque 15 ml de leche en un vaso (“becker”) de 50 ml. Coloque el vaso (“becker”) con una pastilla magnética sobre un plato magnético (agitador/hornilla). Mientras agita comience a calentar hasta alcanzar 40 ºC.    Pese 3 g de sulfato de sodio y añádalo poco a poco a la leche caliente. Luego de que añada todo el sulfato de sodio deje agitando por 10 minutos. Durante este paso se están precipitando las caseínas. Filtre la solución utilizando un sistema al vacío. Esto será explicado por su profesor de laboratorio. Descarte el precipitado y la gasa que utilizó para filtrar.    Coloque el filtrado (contiene α-Lactalbumina y Albuminas) en un vaso (“becker”) y utilizando HCl concentrado ajuste el pH a 3.0. Esto provoca que la Éø-Lactalbumina se precipite.   . 

Protocolo    Transfiera la solución a un tubo de ensayo y centrifugue en la centrifuga clínica por 15 minutos. Descarte el sobrenadante Resuspenda el precipitado en 1.5 ml de agua destilada. Utilizando NaOH 1 N ajuste el pH a 8.5-9.0. Esto le permite a la α-Lactalbumina disolverse en la solución. 7. Centrifugue por 10 minutos en la centrífuga clínica. Transfiera el sobrenadante a un nuevo vaso (“becker”) y ajuste el pH a 4.0. Este paso induce la precipitación de la α-Lactalbumina 8. Centrifugue por 10 minutos en la centrífuga clínica y descarte el sobrenadante (figura 6). Resuspenda el precipitado en 500 µl de 0.05 M bicarbonato de amonio. 

Diálisis 1. Cierre con hilo uno de los extremos de una bolsa de diálisis y coloque en ella la solución de α-Lactalbumina que obtuvo anteriormente. Cierre el otro extremo con hilo y cuelgue la bolsa de diálisis en un agitador de vidrio (figura 7). 2. Obtenga un vaso (“becker”) de 500 ml y llénelo con 0.05 M bicarbonato de amonio. Añada 2 gotas de 0.5 M EDTA para inhibir las proteasas. 3. Coloque el agitador de vidrio con la bolsa de diálisis sobre el vaso (“becker”) y guarde el vaso (“becker”) a 4 ºC por una semana. 4. Luego de una semana saque la bolsa de diálisis del vaso (“becker”) y coloque la solución con α-Lactalbumina en