Cultivo y enumeración de bacteriófagos Dr. José A. Cardé-Serrano Dr. Jesús Lee-Borges Dra. Liza Jiménez Dr. José M. Planas-Rivera Universidad de Puerto Rico en Aguadilla

Objetivo Definir virus Explicar la morfología de un bacteriófago Conocer el ciclo de vida de un virus Realizar técnicas que permitan cultivar y enumerar bacteriófagos

Definición virus El termino virus deriva del latín "veneno” Acido nucleico rodeado de una capa de proteína Veneno –para derivar el termino virus Acido nucleico rodeado de una capa proteica. Propiedad Definitivas Parasito intracelular obligado, Infeccioso – remuevo de una celula, u organismo y lo pongo en otro… la misma infeccion Genoma Viral de DNA o RNA En la celula apropiada: capaz de replicar su genoma y dirigir la sintesis de los componentes virales por la maquinaria de sintesis celular Viriones – progiene viral, infecciosa, formada de novo por componentes recien sintetizados en la celula huesped Un virion sintetizado en el huesped es el vehiculo para transmitir el genoma viral al proximo huesped donde desensamblarse comienza el cilto infeccioso de nuevo.

Introducción Este experimento demuestra la habilidad de los virus de replicarse dentro de células susceptibles. Cultivo de virus Tipos de cultivo Una sola capa Cultivo primario – células vienen directamente del organismo Cultivo secundario – células provienen de linaje de células En suspensión Células no están en un medio sólido sino en un medio liquido Estaremos realizando un Tipo de cultivo de virus para lo que hay q incubarlo con su celula huesped Cultivos hay varios tipos: Medios de cultivo, suplementados y definidos… Monolayer : una sola capa de celulas, inhibicion por contacto se mantiene Cultivo primario – celulas directamente del organismo: disección higado  tripsina, colagenasa  hepatocitos Secundario – linea celular establecida (primario)  pass a nuevas placas … Suspension – celulas mantenidas en medio liquido… Metodos de Detección – como conocer que los virus estan ahi…detectarlos Efectos Citopatologicos: - resultan de celulas enfermas, signos de enfermedad…cambios visibles Tabla 2.1 - Morfologicos – piknosis, sincitios, vacuolas Cuerpos de inclusion – viriones, clumps, Guarnery bodies Plaque assay - Renato Dulbecco modifica de bacteriofago para celulas animales Titular cultivo viral Ensayo de placa - para viruses q causan dano a celulas – Fluorescencia – luego del virus entrar y expresar genes – se permeabilizan y se incuban con AB 1rio y 2rio para viruses q no matan celulas. Centros infecciosos – para determinar q fraccion de células de un cultivo infectado Transformacion – para viruses de cancer, no forman placa, inhibicion por contacto.

Introducción Método de detección Efectos citopatológicos Tabla 2.1 Página 29 Ensayo de placas Fluorescencia Centros infecciosos Ensayo de transformación Páginas 27-33

Cabeza – Proteina y DNA Cuello Collar Funda Base - clavijas Cola Fibras

Ciclo reproductivo de los virus

Entrada La entrada en la célula consta a su vez de dos etapas: la adsorción o fijación del virus en la superficie celular penetración o paso a través de la membrana. Hay una alta especificidad en la fijación de un virus a la membrana de su célula hospedadora. A lo largo de un proceso evolutivo, cada virus ha ido adquiriendo sitios de unión específicos para anclarse en la membrana de un determinado tipo celular. Entrada: Adsorcion y penetrcion Adsorcion – adherirse al la pared o membrana Especificidad entre virus y hospedero dado por receptores. The first step in the replication of the phage in its host cell is called adsorption. The phage particle undergoes a chance collision at a chemically complementary site on the bacterial surface, then adheres to that site by means of its tail fibers. Penetracion – introducir su material genetico o el virus completo Muchas particulas MOI –multiplicity of infection Integracion Multiplicacion Liberacion

Entrada… La penetración a través de la membrana sigue diversas modalidades: el virus completo, solamente su ácido nucleico Por regla general, se necesita la participación de muchas partículas virales para que alguno de ellos logre penetrar en la célula MOI – “Multiplicity of infection” – cuantas partículas virales son necesarias para infectar una célula Entrada: Adsorcion y penetracion Penetracion – Following adsorption, the phage injects its DNA into the bacterial cell. The tail sheath contracts and the core is driven through the wall to the membrane. This process is called penetration and it may be both mechanical and enzymatic. Phage T4 packages a bit of lysozyme in the base of its tail from a previous infection and then uses the lysozyme to degrade a portion of the bacterial cell wall for insertion of the tail core. The DNA is injected into the periplasm of the bacterium, and generally it is not known how the DNA penetrates the membrane. The adsorption and penetration processes are illustrated below. introducir su material genetico o el virus completo Muchas particulas MOI –multiplicity of infection Integracion Multiplicacion Liberacion

el fago libre muestra las fibras y clavijas de la cola. Aproximacion Adhesion Contacto Figura III.1. Esquema de los principales eventos en la adsorción del bacteriófago T4 a la pared celular de la bacteria E. coli. el fago libre muestra las fibras y clavijas de la cola. (b) Adhesión de las fibras de la cola. (c) El fago se acerca a la pared celular y las clavijas entran en contacto con la pared celular.

FIGURA III.2. Esquema del mecanismo de penetración del material genético del fago T4 o T2 a través de la pared celular de la bacteria. Las clavijas del fago entran en contacto con la pared celular y la funda se encuentra extendida. (b) La funda de la cola se contrae y el material genético del fago penetra la pared celular; la lisozima presente en el fago digiere la porción de pared/membrana celular localizada directamente bajo la partícula viral. Penetracion a) contacto B) contraccion de las laminas capas Ayuda de lisozima

http://www.hybridmedicalanimation.com/anim_bacteriophage.html http://video.google.com/videosearch?gbv=2&hl=es&q=hybrid+medical+animations&lr=&um=1&ie=UTF-8&sa=X&oi=video_result_group&resnum=4&ct=title#

Modalidades de penetración en la célula Los virus complejos producen una rotura en la membrana bacteriana en uno de los puntos de anclaje. gracias a la presencia de algunas moléculas de enzimas hidrolíticas entre las proteínas de la capsula. A través de la rotura, el tubo central inyecta el ADN vírico, quedando la capsula vacía en el exterior de la bacteria. La presencia de capsula en la superficie bacteriana es un buen indicio de que la bacteria ha sufrido una infección vírica. Penetracion directa endocitosis Fusion Virus complejos: Sin envoltura: por penetracion directa Por endocitosis Con envoltura - por fusion lipidica Fusion en la membrana celular Fusion con lisosomas

Modalidades de penetración en la célula Otros virus sin envoltura lipídica se introducen en la célula con capsula y todo, lo cual puede realizarse de dos maneras: Por penetración directa: después de la fijación, el virus abre una brecha en la membrana y se introduce en el citoplasma. Por endocitosis: la membrana forma una invaginación en torno al virus, llegando a formar una vesícula que penetra en la célula. Formada la vesícula, el virus abre una brecha en la membrana de la misma con ayuda de algunas enzimas hidrolíticas que él mismo transporta, penetrando así en el citoplasma. Penetracion directa endocitosis Fusion Virus complejos: Sin envoltura: por penetracion directa Por endocitosis Con envoltura - por fusion lipidica Fusion en la membrana celular Fusion con lisosomas

Modalidades de penetración en la célula Los virus con envoltura lipídica burlan la barrera de la membrana celular porque su cubierta lipídica se funde con la membrana, ya que tienen la misma naturaleza. Esta fusión de membranas puede realizarse en dos lugares distintos: Fusión en la superficie celular: de manera que el virión penetra directamente en el citoplasma. Fusión con un lisosoma: se forma una vesícula por endocitosis, a la que se une un lisosoma para digerir la partícula introducida; entonces, la cubierta lipídica del virus se funde con la membrana del lisosoma y el virión escapa hacia el citoplasma. Penetracion directa endocitosis Fusion Virus complejos: Sin envoltura: por penetracion directa Por endocitosis Con envoltura - por fusion lipidica Fusion en la membrana celular Fusion con lisosomas

“Uncoding” Integración La fase de integración corresponde a un tiempo, después de la penetración, en que el virus parece desaparecer, pues no se advierte ningún indicio de su presencia ni de su actividad. Lo que ocurre en esta fase es que se da un desensamblaje de las piezas del virus (si es que ha penetrado completo), y su ácido nucleico queda asimilado en las estructuras celulares aptas para los procesos de replicación y transcripción. Esta fase, variable de unos tipos de virus a otros, termina con la síntesis de los mARN necesarios para que se sinteticen las proteínas que actuarán en la multiplicación del virus. Integracion – ocurre un tiempo despues de la penetrcion -el virurs desaparece por un tiempo no se detecta Esta ocurriendo eldesemsamblaje de la particula Su genoma se asimila por las estructuras celulares asociadas a replicacion y transcripcion Termina con transcripcion…listo para traduccion

Modalidades de fase de integración Ciclo ordinario o lítico: el ácido nucleico vírico procede inmediatamente a la transcripción de su mensaje genético en los mARN necesarios para su multiplicación, y prosigue rápidamente el ciclo vital. Este tipo de ciclo es el más común en la naturaleza. Ciclo lisogénico: fue descubierto por Lwoff en bacteriófagos. El ADN vírico se cierra por sus extremos generando un ADN circular. Este ADN se inserta en el ADN bacteriano en un lugar específico en el que la secuencia de nucleótidos bacterianos es semejante alguna región del ADN vírico. Ciclo Litico El acido nucleico del virus pasa a transcripcion para mRNA q se usara para fabricar nuevos viriones El mas comun Ciclo Lisogenico – Descubierto en bacteriofagos El DNA viral se cierra por los extremos y circulariza Se inserta en el bacteriano latencia

Multiplicación La multiplicación del virus consiste tanto en la replicación de su ácido nucleico, como en la síntesis de las proteínas de la capsula. Los ácidos nucleicos y las proteínas recién sintetizadas se ensamblan rápidamente, produciéndose nuevas partículas víricas. Implica replicacion del acido nucleico y produccion de proteinas de la capsula para ensamblaje

Liberación La liberación del virus consiste en la salida de las nuevas partículas víricas (viriones), que podrán infectar nuevas células iniciando un nuevo ciclo. Salida de particulas virales y comienzo de la infeccion

Laboratorio: Parte Práctica

Medida de unidades infecciosas Se logra inoculando diluciones en serie de un virus en un cultivo de células hospederas. La respuesta puede ser cuantitativa, Ensayos en placas, transformación, Cualitativa Todo o nada Diluciones en serie Inoculadas con la celula huesped Medida cuantitativa - medir Cualitativa – ver

Ensayo en placas PFU (Unidades de formación de placas) Placa – Región clara en el césped de bacterias Infección lítica Lisis de la bacteria PFU = # de placas x factor de dilución 20- 100, 30 – 300 Unidad para titular un stock de virus Pfu: se obtiene de # de manchas (plaques) x la dilucion usada Diluciones: Cuando se hacen diluciones siempre se comienza con una concentración de algo y añades mas del segundo, bajando la concentración del primero. Asi que si haces cálculos y ves que la concentración aumenta!!... algo hicistes mal! Revisa el trabajo para asegurarte que la concentración disminuyó. C1V1=C2V2     Lo importante aquí es definir las variables bien.   Ej: Si tienes un amortiguador de fosfato de sodio 0.2M, y tomas 10 ml de el y lo añades a 90 ml de agua. Cuál es la concentración final de la nueva solución o de la dilución? Cual es el factor de dilucion? Para esta fórmula necesitas 3 de las siguientes 4 variables: C1= concentración inicial, 0.2M V1= volumen inicial, 10ml C2 = ? concentración final a la queda que no sabemos, x, lo que nos preguntan! V2= volumen final, _____ml. Este es un posible punto de error: 90 ml no es el volumen final!!! Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial = 100/10 = 10x o ; .2M a .02M Factores de dilución (fd): es la segunda forma de hacer diluciones. Un factor de dilución es una expresión matemática que te permite calcular cuanto mas diluído esta una solución resultante preparada a partir de una solución “stock”. Se calcula como el volumen final dividido entre el volumen inicial. Cual es el factor de dilución en el ejercicio anterior? 100ml/10ml = 10 o lo que es igual, una dilución de 1 en 10; diluido 10 veces!, 10 veces mas diluido, 10 veces mas concentrado... factor de dilución es 10 Una vez tienes el factor de dilución que hacer? o lo expresas en decimal y lo multiplicas por la C1 o divides la C1 entre el fd. C2=C1/fd; C2=0.2M(.10) =0.02M la [ ] será 1/10 de la original! Diluciones Múltiples: Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la concentración final se calcula : Fd1= 100ml/10ml = 10 Fd2 = 50ml/2ml = 25 Fd3 = 90ml/30ml= 3 FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces… Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentracion: Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM

Materiales: Cinco tubos de agar suave de triptona Cinco platos de agar duro de triptona: Nueve tubos de caldo de triptona: Pipetas 1-ml Cultivo bacteriófago (M-13) Cultivo E. coli

Procedimiento 1. Rotule todos los tubos de dilución de la siguiente manera: - Cinco tubos de agar suave de triptona: 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 - Cinco platos de agar duro de triptona: 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 - Nueve tubos de caldo de triptona: 10-1-10-9 2. Coloque los cinco tubos del agar suave en un baño de María ha 100°C para derretir el agar. Enfriar hasta 55°C y mantenerlo a esta temperatura hasta que lo vaya usar. 3. Con pipetas de 1-ml, realice una dilución en serie (10-1-10-9) de la solución original del bacteriófago usando los nueve tubos de 9-ml del caldo de triptona.

Procedimiento 4. Al tubo de agar suave marcado 10-5, añada dos gotas del cultivo de E.coli y 0.1-ml del caldo de triptona con una concentración de 10-4 del bacteriófago. Mezcle, rotando el tubo de ensayo entre las palmas de su mano. 5. Vierta el contenido del tubo sobre la placa marcada 10-5 antes de que el agar se endurezca. Mueva la placa de manera gentil y uniformemente hasta que el agar suave cubre por completo la placa. Deje que se endurezca. 6. Repita el paso 4 para las soluciones de 10-5-10-9 del caldo de triptona. 7. Incube el plato con los cultivos por 24 horas a 37°C

Replication of M13 in E. coli * Viral (+) strand DNA enters cytoplasm * Complementary (-) strand is synthesized by bacterial enzymes * DNA Gyrase, II topoisomerase, acts on double-stranded DNA and catalyzes formation of negative supercoils in double-stranded DNA * Final product is parental replicative form (RF) DNA * A phage protein, pII, nicks the (+) strand in the RF * 3'-hydroxyl acts as a primer in the creation of new viral strand * pII circularizes displaced viral (+) strand DNA * Pool of progeny double-stranded RF molecules produced * Negative strand of RF is template of transcription * mRNAs are translated into the phage proteins

Replication of M13 in E. coli Phage proteins in the cytoplasm are pII, pX, and pV, and they are part of the replication process of DNA. The other phage proteins are synthesized and inserted into the cytoplasmic or outer membranes. * pV dimers bind newly synthesized single-stranded DNA and prevent conversion to RF DNA * RF DNA synthesis continues and amount of pV reaches critical concentration * DNA replication switches to synthesis of single-stranded (+) viral DNA * pV-DNA structures from about 800 nm long and 8 nm in diamter * pV-DNA complex is substrate in phage assembly reaction Assembly of phage is associated with the membrane of bacteria and requires five capsid proteins, three assembly proteins, ATP, a proton motive force, and at least one bacterial protein, thioredoxin.

¿Preguntas?

Diluciones: Cuando se hacen diluciones siempre se comienza con una concentración de algo (el primero)… Se añade mas del segundo, y el efecto es reducir la concentración del primero. Asi que si haces cálculos y ves que la concentración aumenta!!... algo hicistes mal! Revisa el trabajo para asegurarte que la concentración disminuyó. C1V1=C2V2    

Diluciones…. C1V1=C2V2     Lo importante aquí es definir las variables bien.  Ej: Si tienes un amortiguador de fosfato de sodio 0.2M, y tomas 10 ml de el y lo añades a 90 ml de agua. Cuál es la concentración final de la nueva solución o de la dilución? Para esta fórmula necesitas 3 de las siguientes 4 variables: C1= concentración inicial, 0.2M V1= volumen inicial, 10ml C2 = ? concentración final a la queda que no sabemos, x, lo que nos preguntan! V2= volumen final, 100 ml. Este es un posible punto de error: 90 ml no es el volumen final!!!

Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial Factores de dilución (fd): es la segunda forma de hacer diluciones. Un factor de dilución es una expresión matemática que te permite calcular cuanto mas diluído esta una solución resultante preparada a partir de una solución “stock”. Se calcula como: el volumen final dividido entre el volumen inicial. Cual es el factor de dilución en el ejercicio anterior? 100ml/10ml = 10 o lo que es igual, una dilución de 1 en 10; diluido 10 veces!, 10 veces mas diluido, 10 veces mas concentrado... factor de dilución es 10  

Factor de dilucion: volumen final entre volumen inicial Una vez tienes el factor de dilución que hacer? lo cambias a decimal o fraccion y lo multiplicas por la C1 divides la C1 entre el fd. C2=C1/fd; C2=0.2M/10=0.02M o C2=C1 x fd = 0.2M x 1/10 la [ ] será 1/10 de la original!  

Diluciones Múltiples: Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la concentración final se calcula : Fd1= 100ml/10ml = 10 Fd2 = 50ml/2ml = 25 Fd3 = 90ml/30ml= 3 FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces… Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentracion: Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM Factor Para 10-5 = 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 0.1:1 PFU = 4 x(10X10X10x10x10) = = 4 x (100,000) = 400,000

Diluciones Múltiples: Si vas a hacer un dilución en serie (3 veces o n veces), la concentración final se calcula : Fd1= 100ml/10ml = 10 Fd2 = 50ml/2ml = 25 Fd3 = 90ml/30ml= 3 FDTotal= 10x25x3= 750 a 1 o 750 veces… Si comenzamos con el mismo 0.2M cual sera la nueva concentracion: Cfinal= C1/fdtotal = 0.2M/750 = 0.00027 M = 0.27mM = 270 μM Factor Para 10-5 = 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 0.1:1 PFU = 4 x(10X10X10x10x10) = = 4 x (100,000) = 400,000