BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Dra Daniela Centrón Depto de Microbiología, Parasitología e Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires CONICET

Que es la biología molecular? Estudio de la biología a nivel molecular Se superpone con áreas de la biología y la química, en particular genética y bioquímica Estudio de los procesos celulares

De la genética clásica a la biología molecular al diagnóstico especializado……

CONTENIDOS I. CONCEPTOS BASICOS INTRODUCTORIOS A. Biosíntesis de ácidos nucleicos: replicación, transcripción. B. Biosíntesis de proteínas: traducción. C. Marcos de lectura abiertos. Operones y regulones. II. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE A. Enzimas utilizadas en biología molecular. B. Vectores de clonado y de expresión. C. Construcción de bibliotecas genómicas. III. CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA A. Mutaciones y mutantes. B. Elementos extracromosómicos. Plásmidos. C. Adquisición de material genético exógeno.

IV. METODOLOGIAS BASADAS EN LA IDENTIFICACION DE SECUENCIAS DE A. NUCLEICOS A. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). B. Hibridización de ácidos nucleicos. C. Epidemiología molecular bacteriana. D. ADN ramificado (branched DNA). E. Secuenciación de ácidos nucleicos. V. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE AGENTES ETIOLOGICOS MICROBIANOS A. Bacterias B. Virus C. Hongos D. Mecanismos de resistencia a antibióticos VI. SEMINARIOS DE INTEGRACION

CRONOLOGÍA Genética AM y DM Mendel 1866

GENÉTICA AM Las partículas de la herencia se mezclaban Un parental aporta más que el otro Herencia de caracteres adquiridos

MENDEL Y LOS “FACTORES” DE LA HERENCIA

GENÉTICA DM LA GENÉTICA Y LOS GENES......

Que características debería presentar el material hereditario? ADN o PROTEÍNAS? ….en busca del material hereditario…. Que características debería presentar el material hereditario? Perpetuarse (replicarse) Manifestarse (expresarse) Cambiar (mutar) Combinarse (recombinarse)

1902-Theodore Boveri- William Sutton 1865 Establecen la hipótesis según la cual los cromosomas, segregados de modo mendeliano, son unidades hereditarias.

1915 - T.H. Morgan Los genes se disponían linealmente en el cromosoma 1865 Los genes se disponían linealmente en el cromosoma Se comienza a hablar de genética.....

1928 - Frederick Griffith Transformación de Streptococcus pneumoniae 1865 Colonias “Rugosas” Colonias “Lisas” Transformación de Streptococcus pneumoniae Células L muertas por calor Células L muertas por calor junto a celular R vivas Células L vivas Células R vivas cápsula Bacteria “factor de transformación” Inyección Resultados

El ADN de las células lisas transformaba a las rugosas 1944 - Avery, MacLeod & McCarty 1865 El ADN purificado es “el factor de transformación” El ADN de las células lisas transformaba a las rugosas Oswald Avery Colin MacLeod Maclyn McCarty

Su teoría fue rechazada por dos razones: De ser así cada especie debería tener un tipo diferente de ADN La composición química del ADN era demasiado simple para contener toda la información para la vida

1952 - Hershey & Chase 1865 El ADN viral (no las proteínas) programa las células Martha Chase & Alfred Hershey Bacteriófagos … “los genes se componen de ADN, base química de la herencia”…

LA ESTRUCTURA DEL ADN...

Las bases de ADN siguen ciertas reglas 1947 - Erwin Chargoff 1865 Las bases de ADN siguen ciertas reglas La composición es especie específica A = T, C = G en todas las especies AT GC

1953 - Franklin & Wilkins La naturaleza helicoidal del ADN 1865 La naturaleza helicoidal del ADN Rosalind Franklin Film fotográfico Fuente de rayos X DNA cristalizado Maurice Wilkins

Francis Crick & James Watson 1953 - Watson & Crick 1865 Descripción de la estructura tridimensional del ADN Francis Crick & James Watson

1953 - Watson & Crick Que dedujeron de: Datos de R. Franklin 1865 Que dedujeron de: Datos de R. Franklin hélice doble ancho uniforme de 2 nm bases separadas por 0.34 nm Chargoff la adenina se aparea con la timina la citocina se aparea con la guanina

1953 - Watson & Crick Que dedujeron ellos mismos? 1865 Que dedujeron ellos mismos? Las bases están hacia adentro, y los fosfatos y las azúcares hacia afuera Enlaces de hidrógeno Hebras antiparalelas Sugirieron un modo semi-conservativo de replicación

ESTRUCTURA DEL ADN J. D. WATSON and F. H. C. CRICK ... 2 de abril de 1953, Molecular Structure of Nucleic Acids. A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 171: 737. No más de 900 palabras….. J. D. WATSON and F. H. C. CRICK

QUE ES EL ADN??? Bases nitrogenadas POLÍMERO LARGO, NO RAMIFICADO, COMPUESTO POR CUATRO TIPOS DE SUBUNIDADES Bases nitrogenadas Se combinan con azúcares y fosfatos

Nucleótido=base+azúcar+fosfato Nucleósido=base+azúcar DESOXIRIBONUCLEÓTIDOS Nucleótido=base+azúcar+fosfato Nucleósido=base+azúcar MONÓMERO

Del nucleótido al ADN 5´ DIRECCIÓN (5´a 3´) 5´ ENLACE FOSFODIESTER ENTRE EL CARBONO 5´ DE UNA DESOXIRRIBOSA CON EL GRUPO FOSFATO DEL SIGUIENTE NUCLEÓTIDO FORMANDO UN NUCLEÓTIDO MONOFOSFATO. EL POLÍMERO SE FORMA AL ENLAZAR LOS FOSFATOS AL 3´ DEL OTRO NUCLEÓTIDO 5´ DIRECCIÓN (5´a 3´) 5´

Estructura estabilizada por puentes hidrógeno Doble hebra Antiparalela 5´ 3´ 5´ 3´ ESTRUCTURA PRIMARIA

Apareamiento: A-T G-C Polímero uniforme Surco menor Surco mayor 10 bases por vuelta Surco mayor ESTRUCTURA SECUNDARIA

REGION REGULATORIA Codón de iniciación Codón de terminación

ADN en Procariotas ESTRUCTURA TERCIARIA Cromosoma bacteriano 1865 ESTRUCTURA TERCIARIA Cromosoma bacteriano ADN doble cadena (1mm long) circular cerrado Condensado y ordenado (“supercoiled” o superenrollado)

Plásmidos en Procariotas 1865 Tamaño de 1 a 400Kb Cantidad variable de copias en una célula Origen de replicación propio Pueden movilizarse a otros genomas Puede integrarse al cromosoma bacteriano

ADN en Eucariotas Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos 1865 1 o más cromosomas de ADN (hasta 1200 en helechos) Localizado en núcleo Empaquetado por histonas y otras proteínas cromatina Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos

dos hebras generan una copia cada una Replicación del ADN 1865 Semiconservativa: dos hebras generan una copia cada una

Iniciación comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos 1865 comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos conocida como origen de replicación, en el que hay un gran contenido de adenina y timina.

Origen de replicación (oriC) Iniciación 1865 iniciador Iniciación de la replicación Horquillas se mueven en dirección opuesta ADN lineales (Eucariotas) Varios replicones Síntesis de primers de ARN Unión de iniciador Formación de dos hebras de replicación ADN circulares (Procariotas) Origen de replicación (oriC)

Elongación ADN primasa ARN primer ADN polimerasa III ADN ligasa 1865 ADN primasa ARN primer ADN polimerasa III ADN ligasa Hebra retrasada Frag. de Okazaki Hebra líder Topoisomerasa ADN polimerasa III Helicasa Proteínas de unión al ADNss La ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas, complementarias a cada una de las cadenas primitivas, en sentido 5´ → 3´ partiendo de un ARN corto específico llamado ARN cebador –molécula formada por nucleótidos de ARN catalizados por ARN primasas- que determina el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos.

Pol III escinde G con actividad exonucleasa 3´ a 5´ “Proof-reading” DNA polimerasa comete un error cada 108 – 1010 bases Incorporación de A Incorporación de G X A Pol III escinde G con actividad exonucleasa 3´ a 5´

se completa la doble hélice de ADN. Terminación 1865 Fragmentos de Okazaki Ligasa Cuando una ADN polimerasa hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la ADN ligasa, conecta los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado, catalizando las reacciones de condensación que unen los grupos fosfato y azúcar de los nucleótidos contiguos y así, una vez unidos todos los fragmentos de Okazaki se completa la doble hélice de ADN.

Transferencia de información 1957 - Francis Crick 1865 Propuso el dogma central ADN ARN PROTEINAS Transferencia de información biológica

El ADN y el ARN Ácidos nucleicos Macromoléculas 1865 Ácidos nucleicos Macromoléculas Polímeros (monómero de nucleótidos) Uniones fosfodiéster Moléculas más grandes que se conocen.

Diferencias entre la química del ADN y el ARN 1865 El ARN tiene como carbohidrato a la ribosa en lugar de la desoxirribosa. El ARN tiene como base el uracilo en lugar de la timina. Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN. El ARN no es una doble cadena excepto en algunos virus.

Estructura del ARN 1865

ARNr (ribosomal) Tipos de ARN según sus funciones 1865 Componente principal del ribosoma ARNr (ribosomal) Decodifica el ARNm para sintetizar las proteínas Interacciona con ARNt durante la traducción En Procariotas, dos subunidades principales 30Sy 50S En Eucariotas, 40S y 60

ARNt (de transferencia) Tipos de ARN según sus funciones aa anticodón 1865 ARNt (de transferencia) aa Encargados de transportar los aminoácidos a los ribosomas para incorporarlos a las proteínas, durante el proceso de síntesis proteica. Decodificación mediante apareamiento con el codón del ARNm anticodón

Tipos de ARN según sus funciones 1865 ARNnc o ARN no codificante: ARN funcional que no codifica para síntesis proteica (ARNr y ARNt) ARN corto de interferencia (siARN: del inglés: small interfering RNA ): son componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN involucrados en la regulación. Ribo-llaves (ribo-switches): son formas de ARN que actúan como llaves "encendido-apagado" de gran precisión. ARN catalíticos o ribozimas: ARN con estructura secundaria que le confiere a la molécula propiedades catalíticas como corte de ARN o ADN y ligación. El ARN posiblemente fue el primer biopolímero que apareció en la corteza terrestre durante el transcurso de la evolución.

Como se leen los ARNm??

1961- Nirenberg y Ochoa UUUUUUUU fenilalanina AAAAAAAA lisina 1865 Sistema libre de células UUUUUUUU fenilalanina AAAAAAAA lisina CCCCCCCC prolina GGGGGGG glicina

El código genético 43=64

ARNm

Demostraron que hay 61 tripletes -o codones- que codifican aminoácidos, muchos de los cuales son codificados por más de un codón, por lo que se dice que el código está degenerado. y los tres restantes no son codificantes sino que son utilizados como señales de terminación.

TRANSCRIPCIÓN ADN ARN PROTEINAS Requerimientos: Cadena de ADN 1865 ADN ARN PROTEINAS Requerimientos: Cadena de ADN como matriz ARN polimerasa Ribonucleósidos trifosfatos Región promotora

va a iniciar la transcripción TRANSCRIPCION ARN polimerasa Principio de un gen ADN Iniciación La ARN polimerasa junto a factores de transcripción se une a sitio donde va a iniciar la transcripción

Promotor En bacterias Dos regiones conservadas en el ADN (-10 y -35) que son reconocidas por factor sigma. ARN polimerasa luego se une y sintetiza ARN de 5´ a 3´ Un promotor expresa varios genes (OPERÓN)

Promotor en Eucariotas Región promotora Involucra varios factores de transcripción (proteínas) Cada gen tiene su promotor

TRANSCRIPCION Elongación Hebra antisentido Dirección de la transcripción 3´del gen 5´del gen 5´del ARNm 3´ del ARNm Hebra sentido: contiene la información genética Hebra antisentido: provee el molde para la síntesis del ARNm ARNm Elongación Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN y la ARN polimerasa es la encargada del enlace fosfodiéster.

TRANSCRIPCIÓN Terminación Desestabilización del complejo ARN-ADN La ARN polimerasa deja el ADN ARN mensajero liberado El ADN se aparea nuevamente Terminación Desestabilización del complejo ARN-ADN Rho-independiente (Secuencias palindrómicas del ADN que en estadio de ARN adopta una estructura en horquilla) Rho-dependiente (mediada por la proteína)

TRANSDUCCIÓN ADN ARN PROTEÍNAS El nombre proteína proviene 1865 El nombre proteína proviene de la palabra griega proteios, que significa lo primero. ADN ARN PROTEÍNAS Las proteínas son macromoléculas formadas por aminoácidos

Uniones hidrógeno entre TRADUCCION ARNt Sitio de unión al aminoácido Uniones hidrógeno entre pares de bases Iniciación La iniciación procariótica es el resultado de la asociación de las subunidades pequeña y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt) con el codón de iniciación mediante el emparejamiento de bases anticodón-codón.

La elongación de la cadena polipeptídica TRADUCCION Elongación La elongación de la cadena polipeptídica consiste en la adición de aminoácidos al extremo carboxilo de la cadena.

TRADUCCION Continua la elongación Este proceso continua hasta que llega a un codón stop Polipéptido Creciente

del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt. TRADUCCION Nueva proteína sintetizada Carboxilo terminal Amino terminal Terminación La terminación ocurre cuando se llega a uno de los tres codones de terminación del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt.

Human Gene Nomenclature Committee QUÉ ES UN GEN ? Un segmento de ADN que contribuye a un fenotipo/función. En ausencia de una función demostrable, un gen puede ser caracterizado por secuencia, transcripción u homología. Human Gene Nomenclature Committee

Transcripción policistrónica (ARNm de varios genes) En Procariotas..... Operón Transcripción policistrónica (ARNm de varios genes)

Un promotor para cada gen En Eucariontes... REGION REGULATORIA EXONES FIN TRANSCRIPCION +1 INTRONES Un promotor para cada gen

LA DECADA DE LOS 70 LA ERA RECOMBINANTE

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN MÓLECULAS RECOMBINANTES

Descubrimiento de las enzimas de restricción 1970 - Smith & Nathans 1865 Descubrimiento de las enzimas de restricción Hamilton Smith Descubrió HindII en Haemophilus influenzae Daniel Nathans Utilizó HindII para hacer el primer mapa de restricción del SV40

1972 - Paul Berg El primer ADN recombinante utilizando EcoRI 1865 El primer ADN recombinante utilizando EcoRI Sitios de reconocimientoEcoRI DNA plasmidico EcoRI corta el DNA en fragmentos Extremos pegajosos SV40 DNA DNA ligasa DNA recombinante

Transformación de E. coli con plásmidos recombinantes 1973 - Boyer, Cohen & Chang 1865 Transformación de E. coli con plásmidos recombinantes Gen resistente a la canamicina Gen resistente a la tetraciclina Plasmid pSC101 Stanley Cohen & Annie Chan Medio con canamicina y tetraciclina E. coli transformada con plásmidos recombinantes Sólo crecen colonias recombiantes Herbert Boyer

1977 - Genentech, Inc. 1865 La primera proteína humana producida por una bacteria transgénica (somatostatina) Compañía fundada por Herbert Boyer y Robert Swanson en 1976 Considerada el advenimiento de la edad de la biotecnología

Y LA GENÉTICA DE LA CONSERVACIÓN LA DECADA DE LOS 80 LOS TRANSGÉNICOS Y LAS BASES DE DATOS Y LA GENÉTICA DE LA CONSERVACIÓN

1865 1980 La suprema corte de U.S. permite patentar formas de vida 1985 Se prueban plantas modificadas genéticamente En 1988 el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y el GenBank Margaret Dayhoff

LA DECADA DE LOS 90 GENOMAS Y CLONES

LOS 90: GENOMAS Y CLONES 1865 1995 primer genoma: Haemophilus influenzae. 1996 Genoma de Saccharomyces cerevisiae 1997 Se clona Dolly 1998 Genoma de C. elegans

2000 COMO FUNCIONA UN GENOMA? GENÓMICA Y PROTEÓMICA

26 de junio del 2000: se concluyó el proyecto del GENOMA HUMANO, en el cual se invirtió más de 3.000 millones de dólares…..

EL FUTURO......

Genómica y sociedad Genómica y salud Genómica biológica

MUCHAS GRACIAS!!!!!!!!!!! dcentron@gmail.com