de la TRANSCRIPCION y de la EXPRESION GENICA REGULACION de la TRANSCRIPCION y de la EXPRESION GENICA Curso de Biología Molecular y Genómica para Profesores de Enseñanza Media 2014 Dr. Héctor Toledo Facultad de Medicina, Universidad de Chile

¿ Cómo se organiza el genóma? La Unidad transcripcional Operón bacteriano

¿Es el mRNA eucarióntico complementario al DNA cromosomal? intrones y exones en genes eucariontes

En bacterias la transcripción y la traducción están acopladas

Transcripción en eucariontes DNA Ocurre en el núcleo Transcrito primario no es funcional Nucleus RNA Transcription G AAAAAA RNA Processing mRNA Export G AAAAAA

Procesamiento del transcrito primario ¿Cómo se realiza la maduración del mRNA? Procesamiento del transcrito primario “Capping” en el extremo 5’ Poliadenilación en el extremo 3’ Splicing o remoción de intrones

CAPPING en el extremo5´ - Eficiencia de la Traducción 7-metilguanosina enlace 3´-5´fosfodiester enlace 5´-5´trifosfato CAPPING en el extremo5´ - Eficiencia de la Traducción - Estabilidad del RNA mensajero

Poliadenilación en el extremo 3’ Término de la síntesis del RNA mensajero y síntesis de la cola de poliA Poliadenilación en el extremo 3’ - Eficiencia de la Traducción - Estabilidad del RNA mensajero

¿Existen Señales de Splincing que den cuenta de este proceso? Splicing o remoción de intrones ¿Existen Señales de Splincing que den cuenta de este proceso?

¿Cómo se realiza este proceso? Señales de Splicing Sitio de splicing 5’ Punto de ramificación Sitio de splicing 3’ GU.....................................A........................ …AG Intron ¿Cómo se realiza este proceso?

¿Qué moléculas participan en este evento? Mecanismo de splicing Ataque Nucleofílico enlace fosfodiester inusual 5’-3’ and 5’-2’ Ataque Nucleofílico ¿Qué moléculas participan en este evento?

PROCESAMIENTO ALTERNATIVO Varias señales de poliadenilación Varias señales de splicing

Mecanismo de regulación de las síntesis de proteínas en eucariontes mediante RNA interferente

¿Podemos utilizar este mecanismo en beneficio de la salud? Cell,  150: 895-908, 2012

Terapia Génica Alcoholismo

Genómica funcional

La revolución de les ciencias “ómicas” Genomas Información Genómica Genes Expresión Transcriptómica Proteínas Estructura Actividad Proteómica Metabolitos Composición Cuantificación Metabolómica Organismo Fenotipo Salud y enfermedad

¿Como explorar el genoma? Niveles de análisis de la función génica

Proteómica Análisis de la función de los genes. Transformándose en el campo central de la genómica funcional. Se inicia en 1970s con el diseño de los geles-2D. Alcanza su desarrollo en 1990s con la adaptación de la espectrometría de masa a los problemas biológicos

Proteómica de expresión: su objetivo es medir los niveles de proteínas después de someter el modelo experimental a un estímulo e identificar las proteínas que cambian.

Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturante

Electroforesis en geles de poliacrilamida: método de análisis de proteínas

Isoelectroenfoque

Electroforesis bidimensional

Respuesta al pH ácido Huésped Helicobacter pylori Estrés Lumen Tejido Limitación de Nutrientes Peristaltismo Receptores Quimiotácticos Efectores Huésped Bicarbonato Arginina Otras moléculas Secreción gástrica Respuesta al pH ácido

Análisis mediante electroforesis bidimensional. ¿Se modifica el contenido de proteínas de H. pylori l al exponer la bacteria a un pH levemente ácido ? Análisis mediante electroforesis bidimensional. pH 7 pH 6 Las células se incubaron a pH 7 o pH 6 por 1 hora en presencia de metionina S35. ¿Cómo podemos identificar la identidad de cada mancha?

¿Qué es lo que la espectrometría de masa hace? 1. Es la técnica que mejor determina la masa de las moléculas 2. Da información sobre la estructura química de las moléculas ¿Qué nos permite obtener la espectrometría de masa? Identificar, verificar y cuantificar moléculas

Diagrama de un espectrómetro de masa High Vacuum System Fuente de iones Analizador de masa Base de Datos Entrada Detector

MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Muestra Laser hn Laser ioniza las moléculas. 2. Las molécules (M) se ionizan por transferencia de protones XH+ + M  MH+ + X. MH+ Grid (0 V) +/- 20 kV

El resultado que muestra el espectro de masas Espectro MALDI TOF de IgG MH+ 10000 20000 30000 40000 Relative Abundance (M+2H)2+ (M+3H)3+ 50000 100000 150000 200000 Mass (m/z)

Summary: acquiring a mass spectrum Ionization Mass Sorting (filtering) Detection Ion Source Ion Detector Mass Analyzer Form ions (charged molecules) Sort Ions by Mass (m/z) Detect ions 100 75 Inlet • Solid • Liquid • Vapor 50 25 1330 1340 1350 Mass Spectrum

Gracias por su atención Fin Gracias por su atención