Introducción a la genética y la biología molecular CURSO de VERANO 2009: LA BIOINFORMÁTICA COMO PUENTE ENTRE LA GENÉTICA Y SUS APLICACIONES INDUSTRIALES Y BIOMÉDICAS Introducción a la genética y la biología molecular Dr. Manel Vera Rodríguez (manuel.vera@usc.es)

Breve historia de la genética: 1865: G.J. Mendel presenta sus experimentos con guisantes que muestran los principios de la herencia 1888: W. Waldeyer acuña el término de cromosoma 1900: H. de Vries, C. Correns y E. von Tschermak redescubren la leyes de Mendel 1905: Bateson da el nombre de genética a la disciplina 1908: Hardy y Weinberg formulan el principio de la genética de poblaciones 1910: Morgan descubre la mutación white (ojo blanco) y la herencia ligada al sexo en Drosophila 1941: G.W. Beadle & E.L. Tatum proponen el concepto 1gen-1enzima 1944: Avery demuestra que el ADN es el material hereditario 1953: Watson y F. Crick describen la estructura en doble hélice del ADN 1958: M.S. Meselson y F.W. Stahl demuestran que la replicación del ADN es semiconservativa 1968: Okazaky y colaboradores demuestran la síntesis discontínua de la cadena retardada de ADN 1974: R.D. Kornberg describe la estructura de la cromatina (nucleosomas) 1978: W. Gilbert acuña los términos intrón y exón 1986: Saiki, K.B. Mullis y colaboradores describen la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 1990: Empieza el proyecto Genoma Humano 1995: Primer organismo unicelular secuenciado: Haemophilus influenzae 1996-1997: I. Wilmut y K. Campbell clonan el primer mamífero (oveja Dolly) Historia de la genética

Qué es el ADN? Definición: El Ácido DesoxiriboNucleico (ADN) es el portador de la información genética en las células, compuesto por dos cadenas complementarias de nucleótidos enrolladas en una doble hélice, capaz de autorreplicarse y de dirigir la síntesis de ARN. DNA (nomenclatura inglesa): DeoxiriboNucleic Acid

La estructura del ADN El monómero del ADN es un nucleótido. Los nucleótidos están formados por un azúcar (desoxi-ribosa), una base nitrogenada y un grupo fosfato. Los componentes del nucleótido están unidos por fuertes enlaces covalentes (fosfodiester). Las bases son purinas (Guanina y Adenina) y pirimidinas (Citosina y Timina). La estructura del ADN está formada por 2 cadenas complementarias. Las 2 cadenas están orientadas en direcciones opuestas, quedando en cada una un extremo 5’ (fosfato) y un extremo 3’ (hidroxilo). La unión entre las 2 cadenas se realiza mediante enlaces de hidrógeno entre 2 bases (1 de cada cadena), formando un “par de bases”. La Adenina se une siempre a la Timina mediante 2 enlaces. La Guanina se une siempre a la Citosina mediante 3 enlaces. Los grupos hidroxilo libres del fosfato son los que dan una fuerte carga eléctrica negativa y el carácter ácido a la molécula La molécula de ADN se enrrolla en la forma de una doble hélice. Por cada 10 pares de bases, la molécula gira 360º. La estructura recuerda a una escalera de caracol.

La estructura del ADN Estructura del ADN

Genes y Genomas Un gen es un fragmento de ADN que contiene la información necesaria (en forma de secuencia de bases) para codificar la síntesis de una proteína o un ARN. Podemos considerar a un gen como una unidad de información. No todo el material genético de un organismo está organizado en genes. Existe ADN no codificante. En las células humanas solamente el 3% del ADN da lugar a la síntesis de proteínas El genoma de un organismo es el conjunto de material genético que contienen sus células.

Tamaño de los genomas El virus más pequeño contiene poco más de 4.000 pares de bases. Una bacteria contiene como media 5.106 pares de bases (5.000 Kb o 5 Mb) (2 m de longitud). Como norma general las bacterias (células procariotas) contienen una sola molécula de ADN circular, mientras que las células eucarióticas (animales y vegetales) contienen varias moléculas de ADN lineal organizadas en cromosomas. Una célula humana contiene 3.000 Mb distribuidas en 46 cromosomas. Cada cromosoma contiene una molécula lineal de ADN.

Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Tamaño de los genomas   Tamaño Genoma  Organismo (pares de bases) Fago λ 5×104 Escherichia coli 4×106 Levadura 2×107 Caenorhabditis elegans 8×107 Drosophila melanogaster 2×108 Humano 3×109

Organización del material genético El material genético de las células procarióticas se organiza habitualmente en 1 sólo cromosoma que contiene una molécula de ADN circular. El material genético de las células eucarióticas se organiza en cromosomas. Cada uno está formado por una mólecula de ADN en doble hélice lineal asociado a proteínas básicas (histonas) formando la cromatina. Estructura del cromosoma eucariota

Mitosis Definición: División celular caracterizada por la replicación de los cromosomas y la formación de dos núcleos hijos idénticos entre sí (cariocinesis), seguido de la partición del citoplasma (citocinesis), para formar dos células hijas. Tiene cuatro fases:

Mitosis Animación Mitosis

Cariotipo Definición: ordenamiento de los cromosomas de una célula metafásica de acuerdo a su tamaño y morfología. A: Metacéntricos grandes B: Submetacéntricos grandes C: Submetacéntricos medianos D: Acrocéntricos medianos E: Submetacéntricos pequeños F: Metacéntricos pequeños G: Acrocéntricos pequeños Par sexual Cariotipo humano: 2n= 46 (Diploide= doble dotación cromosómica, cromosomas por pares) 23 pares de cromosomas homólogos

Cariotipo El cariotipo es característico de cada especie

Qué es el ARN? Definición: El Ácido RiboNucleico (ARN) se distingue del ADN por la presencia del azúcar ribosa y la pirimidina Uracilo; incluye ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosómico (ARNr). También es el material genético de muchos virus, llamados retrovirus. RNA (nomenclatura inglesa): RiboNucleic Acid

Estructura del ARN El ARN (ácido ribonucleico) contiene ribosa en lugar de desoxi-ribosa. Está formado por las mismas bases nitrogenadas, excepto la Timina que se sustituye por Uracilo. El Uracilo es también complementario de la Adenina. A diferencia del ADN está formado por una única cadena de nucleótidos. La longitud de la cadena es mucho menor que en el ADN. Se pueden formar enlaces entre bases complementarias dentro de la misma cadena, lo que origina estructuras tridimensionales complejas.

Tipos de ARN TIPO ABUN-DANCIA Nº BASES FUNCION ARNr Ribosómico 80% 120-3500 Estructura de los ribosomas ARNt Transferencia 15% 75 Transporte de aminoácidos ARNm Mensajero 5% variable Síntesis de proteínas

Dogma fundamental de la biología molecular Cómo es el flujo de información genética en los seres vivos. Tres procesos fundamentales: Replicación Transcripción Traducción ADN ARN PROTEÍNAS Transcripción inversa (retrovirus)

De los genes a las proteínas

La replicación del ADN

La replicación del ADN Conservativa Semiconservativa Dispersiva Esquema Experimentos Meselson y Stahl (1958)

La replicación del ADN Catalizada por una ADN-polimerasa que añade nucleótidos al extremo 3’-OH de la cadena naciente (sentido polimerización= 5’ a 3’). La ADN-polimerasa necesita un cebador de ARN. Los nucleótidos se añaden por emparejamiento complementario con las bases de la cadena molde. Los sustratos, desoxi-ribonucleótido trifosfato (dNTP) se hidrolizan al añadirse, liberando energía para la síntesis del ADN. Existen diversas proteínas que colaboran en la replicación. DNA pol ARN cebador

La replicación del ADN

Transcripción Garret & Grisham. Biochemistry 2ª ed. Saunders College Publishing La síntesis del ARNm la realiza una ARN polimerasa en dirección 5’--> 3’. Los ribonucleótidos se añaden por emparejamiento complementario con las bases de la cadena molde de ADN. La presencia de Adenina en el ADN determina la adición de un Uracilo en el ARN.

Transcripción Eucariotas Procariotas (bacterias) Características generales de la transcripción Cada gen codifica proteínas y por ende, cada molécula de mRNA transcrita, codifica un único polipéptido: mRNA monocistrónico La transcripción y la traducción son procesos secuenciales que ocurren en el núcleo y el citoplasma, respectivamente Una única molécula de mRNA puede codificar varios polipéptidos: mRNA policistrónico La traducción y la transcripción ocurren en forma acoplada en el mismo (único) compartimento celular RNA polimerasas involucradas Hay 3 polimerasas diferentes: RNA polimerasa I: precursor del rRNA que formará las subunidades de los ribosomas (28S, 5,8S y 18S). - RNA polimerasa II: mRNA y algunos snRNA. RNA polimerasa III: tRNA, un tipo de rRNA (5S) y una variedad de RNA pequeños Hay una sola RNA polimerasa que cataliza la biosíntesis de los tres tipos de RNA: mRNA, tRNA y rRNA Secuencias reguladoras de la transcripción Hay múltiples regiones de control. Algunas secuencias están cerca del sitio de inicio (caja TATA) y otras más distantes Hay 2 secuencias (denominadas secuencias consenso) a -10 y -35 pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción A partir de Curtis, Barnes, Schnek & Massarini. Biología. 7ª ed. Editorial Médica Panamericana

La transcripción en procariotas Los genes que codifican proteínas involucradas en la misma ruta metabólica suelen presentarse agrupados en el cromosoma, formando operones, lo que permite la expresión coordinada. Una región reguladora adyacente al operón, determina su transcripción- es el “operador”. Proteínas reguladoras funcionan con los operadores, para controlar la transcripción de los genes.

La transcripción en eucariotas La Cromatina limita el acceso de las proteínas reguladoras a los promotores. Existen factores proteicos que deben reorganizar la cromatina. Las RNA polimerasas I, II y III transcriben rRNA, mRNA y tRNA, respectivamente. Las 3 polimerasas interaccionan con los promotores a través de los “factores de transcripción”. La “TATA box” (TATAAA) es un promotor “consenso”. Los factores de transcripción reconocen secuencias promotoras específicas e inician la transcripción (algunos factores se unen a secuencias específicas en la región codificante del gen). Además de promotores, los genes eucariotas tienen “enhancers”, o “upstream activation sequences”. Garret & Grisham. Biochemistry 2ª ed. Saunders College Publishing

Estructura del gen eucariota Los genes eucariotas están divididos en exones (se traducen a aminoácidos) e intrones (no codificantes). Ejemplos: El gen de la actina tiene un intrón de 309-pb que separa los primeros 3 aminoácidos de los restantes 350. El gen del colágeno pro-alpha-2 del pollo, mide 40-kb, con 51 exones que suman sólo 5 kb. Los exones suelen medir entre 45 y 249 bases. El mecanismo por el que se escinden los intrones y por el que se unen los exones, es complejo y muy preciso (“RNA- splicing”)

Estructura del gen eucariota Maduración RNAm en eucariotas Garret & Grisham. Biochemistry 2ª ed. Saunders College Publishing Transcripción y maduración RNAm

Traducción del mensaje genético La información contenida en la secuencia de bases del ADN es trasladada o traducida a una secuencia de aminoácidos en una proteína, a través del ARN que actúa como intermediario Garret & Grisham. Biochemistry 2ª ed. Saunders College Publishing

Las proteínas Aminoácidos que forman las proteínas Alanina Ala A Arginina Arg R Asparragina Asn N Aspártico Asp D Cisteína Cys C Fenilalanina Phe F Glicina Gly G Glutámico Glu E Glutamina Gln Q Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Prolina Pro P Serina Ser S Tirosina Tyr Y Treonina Thr T Triptófano Trp W Valina Val V No polar Polar Alcalino Ácido

Las proteínas Aminoácidos que forman las proteínas Alanina Ala A Arginina Arg R Asparragina Asn N Aspártico Asp D Cisteína Cys C Fenilalanina Phe F Glicina Gly G Glutámico Glu E Glutamina Gln Q Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Prolina Pro P Serina Ser S Tirosina Tyr Y Treonina Thr T Triptófano Trp W Valina Val V Aa esenciales (obtenidos de la dieta) No polar Polar Alcalino Ácido

Síntesis de proteínas La síntesis transcurre desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal. Los ribosomas leen el ARNm en la dirección 5’--3’. La traducción tiene lugar en polirribosomas o polisomas. Hay más de un ribosoma traduciendo cada ARNm simultáneamente. La elongación de la cadena proteica tiene lugar por adición secuencial de aminoácidos al extremo C-terminal. El ARNt tiene en el extremo 3’ el lugar de unión del aa, y en uno de sus bucles el anticodón complementario al codón del ARNm Garret & Grisham. Biochemistry 2ª ed. Saunders College Publishing

Síntesis de proteínas Initiation

El código genético Cada aminoácido está codificado por una secuencia de 3 nucleótidos en el ARNm llamada codón. Las combinaciones de las 4 bases tomadas de 3 en 3 originan 64 posibles permutaciones. Puesto que solamente existen 20 aminoácidos formando parte de las proteínas, el código es redundante o degenerado: existen codones sinónimos. Existe además un codón que marca el inicio de una proteína y 3 codones que marcan el fin.

El código genético ORIGIN (Ribonucleasa pancreática bovina) 1 ggcagaaact gccttctctc tctcagacat caaactagag acccaggttt ctccagggga 61 gtgcggtcat catggctctg aagtccctgg tcctgttgtc gctgttggtc ctggtgctgc 121 tgctggtgcg ggtccagcct tccctgggca aggaaactgc agcagccaag tttgagcggc 181 agcacatgga ctccagcact tccgctgcca gcagctccaa ctactgtaac cagatgatga 241 agagccggaa cctgaccaaa gatcgatgca agccagtgaa cacctttgtg cacgagtccc 301 tggctgatgt ccaggccgtg tgctcccaga aaaatgttgc ctgcaagaat gggcagacca 361 attgctacca gagctactcc accatgagca tcaccgactg ccgtgagacc ggcagctcca 421 agtaccccaa ctgtgcctac aagaccaccc aggcgaataa acacatcatt gtggcttgtg 481 agggaaaccc gtacgtgcca gtccactttg atgcttcagt gtaggtctct acctaaggcc 541 agagcagcaa gatgcaccac ttcatcacaa aggcacctgc ctctcccctc atgtttcctt 601 gtcctggggg caatagctca agttagttag ggctcttatc tctgcgcacc ttaccagaaa 661 cacacacaca ggattccctg gcatgaaagc aataactcaa gctagttaag tcttctatcc 721 aacccacact tgctcccctg gcctgagtct tgcccctggt ggtttggggg gtgaggagtg 781 ggttgtgagg tgggacctgt gttaaccaaa tcactgcttc tttcaataaa catacttgca 841 accacctgaa aaaaaaaaaa aaaa //

El código genético ORIGIN (Ribonucleasa pancreática bovina) 1 ggcagaaact gccttctctc tctcagacat caaactagag acccaggttt ctccagggga 61 gtgcggtcat catggctctg aagtccctgg tcctgttgtc gctgttggtc ctggtgctgc 121 tgctggtgcg ggtccagcct tccctgggca aggaaactgc agcagccaag tttgagcggc 181 agcacatgga ctccagcact tccgctgcca gcagctccaa ctactgtaac cagatgatga 241 agagccggaa cctgaccaaa gatcgatgca agccagtgaa cacctttgtg cacgagtccc 301 tggctgatgt ccaggccgtg tgctcccaga aaaatgttgc ctgcaagaat gggcagacca 361 attgctacca gagctactcc accatgagca tcaccgactg ccgtgagacc ggcagctcca 421 agtaccccaa ctgtgcctac aagaccaccc aggcgaataa acacatcatt gtggcttgtg 481 agggaaaccc gtacgtgcca gtccactttg atgcttcagt gtaggtctct acctaaggcc 541 agagcagcaa gatgcaccac ttcatcacaa aggcacctgc ctctcccctc atgtttcctt 601 gtcctggggg caatagctca agttagttag ggctcttatc tctgcgcacc ttaccagaaa 661 cacacacaca ggattccctg gcatgaaagc aataactcaa gctagttaag tcttctatcc 721 aacccacact tgctcccctg gcctgagtct tgcccctggt ggtttggggg gtgaggagtg 781 ggttgtgagg tgggacctgt gttaaccaaa tcactgcttc tttcaataaa catacttgca 841 accacctgaa aaaaaaaaaa aaaa // CDS 72..524 /gene="RNASE1" /note="ribonuclease A (pancreatic)" /codon_start=1 /product="ribonuclease" /protein_id="NP_001014408.2" /db_xref="GI:68299789" /db_xref="GeneID:282340" /translation="MALKSLVLLSLLVLVLLLVRVQPSLGKETAAAKFERQHMDSSTS AASSSNYCNQMMKSRNLTKDRCKPVNTFVHESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSY STMSITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVHFDASV"

El código genético ORIGIN (Ribonucleasa pancreática bovina) 1 ggcagaaact gccttctctc tctcagacat caaactagag acccaggttt ctccagggga 61 gtgcggtcat catggctctg aagtccctgg tcctgttgtc gctgttggtc ctggtgctgc 121 tgctggtgcg ggtccagcct tccctgggca aggaaactgc agcagccaag tttgagcggc 181 agcacatgga ctccagcact tccgctgcca gcagctccaa ctactgtaac cagatgatga 241 agagccggaa cctgaccaaa gatcgatgca agccagtgaa cacctttgtg cacgagtccc 301 tggctgatgt ccaggccgtg tgctcccaga aaaatgttgc ctgcaagaat gggcagacca 361 attgctacca gagctactcc accatgagca tcaccgactg ccgtgagacc ggcagctcca 421 agtaccccaa ctgtgcctac aagaccaccc aggcgaataa acacatcatt gtggcttgtg 481 agggaaaccc gtacgtgcca gtccactttg atgcttcagt gtaggtctct acctaaggcc 541 agagcagcaa gatgcaccac ttcatcacaa aggcacctgc ctctcccctc atgtttcctt 601 gtcctggggg caatagctca agttagttag ggctcttatc tctgcgcacc ttaccagaaa 661 cacacacaca ggattccctg gcatgaaagc aataactcaa gctagttaag tcttctatcc 721 aacccacact tgctcccctg gcctgagtct tgcccctggt ggtttggggg gtgaggagtg 781 ggttgtgagg tgggacctgt gttaaccaaa tcactgcttc tttcaataaa catacttgca 841 accacctgaa aaaaaaaaaa aaaa // CDS 72..524 /gene="RNASE1" /note="ribonuclease A (pancreatic)" /codon_start=1 /product="ribonuclease" /protein_id="NP_001014408.2" /db_xref="GI:68299789" /db_xref="GeneID:282340" /translation="MALKSLVLLSLLVLVLLLVRVQPSLGKETAAAKFERQHMDSSTS AASSSNYCNQMMKSRNLTKDRCKPVNTFVHESLADVQAVCSQKNVACKNGQTNCYQSY STMSITDCRETGSSKYPNCAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVHFDASV"

El código genético pautas de lectura (ORF’s) N- ile leu phe arg val ile arg pro ... thr arg asn phe thr ... arg -C 2 N- tyr phe ile ser ser asn ser thr leu asn ala lys leu his leu thr -C 1 N- leu phe tyr phe glu ... phe asp leu lys arg glu thr ser leu asn -C sentido de lectura para la secuencia de la cadena superior 5’- TTATTTTATTTCGAGTAATTCGACCTTAAACGCGAAACTTCACTTAAC –3’ 3’- AATAAAATAAAGCTCATTAAGCTGGAATTTGCGCTTTGAAGTGAATTG –5’ DNA sentido de lectura para la secuencia de la cadena inferior -1 C- ... lys ile glu leu leu glu val lys phe ala phe ser ... lys val -N -2 C- ile lys asn arg thr ile arg gly ... val arg phe lys val ... arg -N -3 C- asn ... lys ser thr asn ser arg leu arg ser val glu ser leu ser -N pautas de lectura (ORF’s) (ORF’s: Open Reading Frame, pauta abierta de lectura)

El código genético pautas de lectura (ORF’s) N- ile leu phe arg val ile arg pro ... thr arg asn phe thr ... arg -C 2 N- tyr phe ile ser ser asn ser thr leu asn ala lys leu his leu thr -C 1 N- leu phe tyr phe glu ... phe asp leu lys arg glu thr ser leu asn -C sentido de lectura para la secuencia de la cadena superior 5’- TTATTTTATTTCGAGTAATTCGACCTTAAACGCGAAACTTCACTTAAC –3’ 3’- AATAAAATAAAGCTCATTAAGCTGGAATTTGCGCTTTGAAGTGAATTG –5’ DNA sentido de lectura para la secuencia de la cadena inferior -1 C- ... lys ile glu leu leu glu val lys phe ala phe ser ... lys val -N -2 C- ile lys asn arg thr ile arg gly ... val arg phe lys val ... arg -N -3 C- asn ... lys ser thr asn ser arg leu arg ser val glu ser leu ser -N pautas de lectura (ORF’s) (ORF’s: Open Reading Frame, pauta abierta de lectura)

El código genético pautas de lectura (ORF’s) N- ile leu phe arg val ile arg pro ... thr arg asn phe thr ... arg -C 2 N- tyr phe ile ser ser asn ser thr leu asn ala lys leu his leu thr -C 1 N- leu phe tyr phe glu ... phe asp leu lys arg glu thr ser leu asn -C sentido de lectura para la secuencia de la cadena superior 5’- TTATTTTATTTCGAGTAATTCGACCTTAAACGCGAAACTTCACTTAAC –3’ 3’- AATAAAATAAAGCTCATTAAGCTGGAATTTGCGCTTTGAAGTGAATTG –5’ DNA sentido de lectura para la secuencia de la cadena inferior -1 C- ... lys ile glu leu leu glu val lys phe ala phe ser ... lys val -N -2 C- ile lys asn arg thr ile arg gly ... val arg phe lys val ... arg -N -3 C- asn ... lys ser thr asn ser arg leu arg ser val glu ser leu ser -N pautas de lectura (ORF’s) (ORF’s: Open Reading Frame, pauta abierta de lectura)

Mutaciones

Variabilidad genética Las mutaciones son el proceso principal para crear variabilidad genética. Definición: Cambios entre los individuos para un determinado gen o carácter. Si existen diferentes variantes de un mismo gen, se dice que es “polimórfico”, si no hay variabilidad el gen es “monomórfico”.

Variabilidad genética

SNPs Los SNPs o “polimorfismos de nucleótido único” son variaciones de la secuencia de bases de una región del genoma, que afectan a un único nucleótido. Para ser considerado un SNP debe ocurrir en al menos un 1% de la población. Los SNPs proporcionan el 90% de la variación genética humana y ocurren cada 100 o 300 bases a lo largo de todo el genoma (tanto en regiones codificantes como no codificantes). 2 de cada 3 SNPs corresponden a la sustitución de C por T. Una gran parte no tienen efecto alguno sobre las funciones celulares, pero algunos pueden producir alteraciones o cambios diversos.

SNPs y Haplotipos Un determinado número de SNPs en una región concreta, crea un haplotipo (diferentes secuencias que puede tener un fragmento concreto de ADN). Cada haplotipo contiene SNPs característicos. Mapa de Haplotipos (Hap Map): mapa de los haplotipos y los SNPs que los caracterizan. Está permitiendo la identificación de genes y variaciones que afectan a la salud humana.

Haplotipos [ 1 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #ATcs1 ATTTTTCAGC TATGTACAAT AACAATTGTT GTACCTTGCT AACCCAATGT TATACTACAT CTATGTATAA TATTACATAT #ATcs2 ATTTTTCAGC TATGTACAAT AACAATTGTC GTACCTTGCT AACCCAATGT TATACTACAT CTATGTATAA TATTACATAT #ATcs3 ATTTTTCAGC TATGTACAAT AACAATTGTT GTACCTTGCT AACCCAATAT TATACTACAT CTATGTATAA TATTACATAT #ATcs4 ATTTTTCAGC TATGTACAAT AACAATTGTT GTACCTTGCT AACCCAATGT TATACTACAT CTATGTATAG TATTACATAT [ 1 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 ] [ 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 ] #ATcs1 TATGTATTTA CCCATATATA TAATATAGCA TG-TGAGTAG TACATCATAT GTATTATCAA CATTAGTGAA TTTAACCCCT #ATcs2 TATGTATTTA CCCATATATA TAATATAGCA TG-TGAGTAG TACATCATAT GTATTATCAA CATTAGTGAA CTTAACCCCT #ATcs3 TATGTATTTA CCCATATATA TAATATAGCA TGATGAGTAG TACATCATAT GTATTATCAA CATTAGTGAA TTTAACCCCT #ATcs4 TATGTATTTA CCCATATATA TAATATAGCA TG-TGAGTAG TACATCATAT GTATTATCAA CATTAGTGAA TTTAACCCCT

Haplotipos [ 1 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 ] [ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ] #ATcs1 ATTTTTCAGC TATGTACAAT AACAATTGTT GTACCTTGCT AACCCAATGT TATACTACAT CTATGTATAA TATTACATAT #ATcs2 .......... .......... .........C .......... .......... .......... .......... .......... #ATcs3 .......... .......... .......... .......... ........A. .......... .......... .......... #ATcs4 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .........G .......... [ 1 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 ] [ 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 ] #ATcs1 TATGTATTTA CCCATATATA TAATATAGCA TG-TGAGTAG TACATCATAT GTATTATCAA CATTAGTGAA TTTAACCCCT #ATcs2 .......... .......... .......... ..-....... .......... .......... .......... C......... #ATcs3 .......... .......... .......... ..A....... .......... .......... .......... .......... #ATcs4 .......... .......... .......... ..-....... .......... .......... .......... ..........

Haplotipos y variabilidad La variación de la secuencia de bases en un gen determinado puede cambiar la proteína codificada por ese gen.

Microsatélites Los microsatélites son secuencias de ADN no codificante con motivos repetidos en tándem (entre 1-6 pares de bases) repartidas por todo el genoma Normalmente son marcadores codominantes y neutrales y son utilizados en estudios de genética de poblaciones y en análisis de parentesco

Microsatélites Formación de microsatélites: Fallos de la polimerasa (Slipped-strand mispairing) Inestabilidad del acoplamiento de las dos cadenas en individuos heterocigotos (mutaciones más frecuentes cuando la diferencia de tamaño entre las cadenas es más elevada)

Microsatélites Homocigoto (378/378) Homocigoto (378/378) Heterocigoto (376/378) Homocigoto (376/376)

Variabilidad genética: Definiciones Gen: Todo segmento de ADN que se encuentra a continuación de un promotor y que puede ser transcrito por una ARN polimerasa y originar un ARN funcional (ARNm, ARNr, ARNt, ARNsn, ribozima u otros tipos de ARN) Alelo: Cada una de las formas diferentes de un gen. Los alelos ocupan la misma posición (locus) en los cromosomas homólogos. Locus: La posición de un gen en un cromosoma; para cualquier locus dado puede haber varios alelos posibles

Variabilidad genética: alelos

¿Cómo podemos detectar la variabilidad genética del ADN en el laboratorio?

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Principio: Se basa en la metodología de la replicación. Se utilizan cebadores o primers que flanquean la región de interés y son necesarios para que la ADN polimerasa actúe. Realizándose múltiples ciclos de replicación, conseguimos una amplificación exponencial del producto.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Principio: Se basa en la metodología de la replicación. Se utilizan cebadores o primers que flanquean la región de interés y son necesarios para que la ADN polimerasa actúe. Realizándose múltiples ciclos de replicación, conseguimos una amplificación exponencial del producto. Consiste en tres pasos: Desnaturalización del ADN molde a 95ºC

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Principio: Se basa en la metodología de la replicación. Se utilizan cebadores o primers que flanquean la región de interés y son necesarios para que la ADN polimerasa actúe. Realizándose múltiples ciclos de replicación, conseguimos una amplificación exponencial del producto. Consiste en tres pasos: Desnaturalización del ADN molde a 95ºC Hibridación o annealing del cebador con ADN molde a Ta idónea

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Principio: Se basa en la metodología de la replicación. Se utilizan cebadores o primers que flanquean la región de interés y son necesarios para que la ADN polimerasa actúe. Realizándose múltiples ciclos de replicación, conseguimos una amplificación exponencial del producto. Consiste en tres pasos: Desnaturalización del ADN molde a 95ºC Hibridación o annealing del cebador con ADN molde a Ta idónea Extensión mediante actuación de la ADN polimerasa a 72ºC Animación PCR

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Secuenciación (Sanger) La secuenciación de DNA usando el método de Sanger (1977) emplea 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfatados además de los normales 2’-deoxinucleótido trifosfatado Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfato carecen del grupo 3’ hidroxilo, y la polimerización del DNA ocurre solo en la dirección 3’, cada vez que un 2’3’-dideoxinucleótido trifosfato es incorporado la extención se detiene H P O OH HO CH2 NH2 N Azucar Base Fosfato 3’ 5’ 2’ 1’ 4’ 2’-deoxinucleótido monofosfato

Secuenciación (Sanger) La secuenciación de DNA usando el método de Sanger (1977) emplea 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfatados además de los normales 2’-deoxinucleótido trifosfatado Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfato carecen del grupo 3’ hidroxilo, y la polimerización del DNA ocurre solo en la dirección 3’, cada vez que un 2’3’-dideoxinucleótido trifosfato es incorporado la extención se detiene OH Fosfato NH2 HO P O Base N O N N N CH2 5’ O 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato 4’ 1’ Azucar 3’ 2’ H H

Secuenciación

Secuenciación

Secuenciación Fragmentos de ADN marcados fluorescentemente migran a través del capilar Fragmentos de ADN pasan a través del láser y detector óptico Electroforesis capilar

Secuenciación Cromatograma Insertar cromatogramas