MEDICIÓN DE METABOLITOS MICROBIANOS UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MEDICIÓN DE METABOLITOS MICROBIANOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Dr. Iván Salmerón Equipo: Carolina Nájera Domínguez Ana Luisa Herrera Ponce Edmundo Juárez Enríquez Chihuahua, Chihuahua A 14 de Febrero del 2011

Metabolismo Red de Reacciones Bioquímicas con las que el organismo obtiene la energía requerida para todas sus actividades Catabolismo: degradación de moléculas para obtener energía Anabolismo: formación de moléculas y componentes estrucurales

Metabolito: es una molécula utilizada y/o producida durante el metabolismo Puede ser intermediario o final, dependiendo del lugar que ocupe en la ruta metabólica Primario y Secundario Primario: producido en la fase primaria de crecimiento del metabolismo Secundario: producido al final de la fase primaria de crecimiento y comienzo de la fase estacionaria. Generalmente a partir de productos productos intermedios acumulados sea en el medio de cultivo o en las células, durante el metabolismo primario. Estos tipos de metabolismo se ven relacionados porque los productos del primario son los sustratos del secundario.

CUANTIFICACIÓN DE METABOLITOS TÉCNICA MICROORGANISMO Peróxidos Titulación Ácido acético BAL Acetaldehído Indol Cromatografía líquida de alta eficacia Riboflavina (B2) Ashbya gossypii Lisina Brevibacterium flavium Sorbosa Ácido glucónico Nefelometría Glicerol Espectroscopia de masas Cobalamina (B12) Electroforesis Propionibacterium Pseudomonas dinitrificans SIGUIENTE

CUANTIFICACIÓN DE METABOLITOS TÉCNICA MICROORGANISMO Fenoles Espectrofotometría Titulación Ácido glutámico Corynebacterium glutamicum Ácido láctico Lactobacillus Etanol Ebulloscopía Saccharomyces cerevisiae Indol Fluorimetría Cromatografía en capa fina Aminas Ácido succínico Ácido fumárico Ácido cítrico Aspergillus niger Glicerol Cromatografía de gases ATRAS SIGUIENTE

CUANTIFICACIÓN DE METABOLITOS TÉCNICA MICROORGANISMO Toxinas: Cromatografía líquida de alta eficacia Aflatoxinas Aspergillus flavus Fumonisina B1 Fusarium Enterotoxina A RIA Staphylococcus aureus Enzimas: Método de Tatini Desoxirribonucleasa termoestable ATRAS

ESPECTROSCOPÍA DE MASAS Separación de partículas moleculares o atómicas por su diferente masa. El proceso comprende cuatro etapas: ionización de la muestra, aceleración de los iones por un campo eléctrico, dispersión de los iones según su masa/carga y detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica. INICIO

ELECTROFORESIS Se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. INICIO

NEFELOMETRÍA Se basa en la dispersión de la radiación que atraviesan las partículas de materia. La intensidad de la radiación resultante depende de: el número de partículas suspendidas, su tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada. INICIO

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC) Separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. INICIO http://www.bvs.sld.cu/revistas/pla/vol_15_1_10/pla02110.htm

TITULACIÓN Análisis químico en el que un reactivo llamado “titulador” de volumen y concentración conocida se utiliza para que reaccione con una solución del analito de concentración desconocida. Utilizando una bureta calibrada para añadir el valorante es posible determinar la cantidad exacta que se ha consumido cuando se alcanza el punto final de la titulación. INICIO

EBULLOSCOPÍA La ebulloscopía es la determinación del punto de ebullición de un líquido en el que se halla disuelta una sustancia, lo que permite conocer el grado de concentración de la solución. El soluto que se encuentra en un líquido disminuye su presión de vapor, lo que se traduce en un incremento del punto de ebullición. INICIO

ESPECTROFLUOROMETRÍA La espectroscopia de fluorescencia es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia a partir de una muestra. La espectroscopia de fluorescencia utiliza un rayo de luz, normalmente ultravioleta, que excita a los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y hace que emitan luz. INICIO

ESPECTROFOTOMETRÍA El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. INICIO

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA Se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un absorbente mantenido sobre una placa. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. INICIO

CROMATOGRAFÍA DE GASES La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. El gas portador cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. INICIO

MÉTODO DE TATINI 20 g de muestra + 40 mL de agua destilada (ajustar pH 3.8) Centrifugación  adicionar ácido tricloroacético en frío al centrifugado Centrifugar  disolver en tris-buffer-metil-aminometano y en 1 mL de Cl2Ca 0,1M (pH a 8,6) Ebullición por 15 min.  enfriado a 50°C Extracción a pocillos en agar-DNasa azul de toluidina Incubación 37°C x 24 hrs. Rosa =positivo INICIO

ELISA Para detectar antígenos (toxina, enzima etc, que nos interese) . El pocillo está cubierto con anticuerpos al que se une el antígeno, al cual, posteriormente se le une un segundo anticuerpo marcado con una enzima que finalmente da un color, indicando una prueba positiva INICIO

RADIOENZIMOINMUNOANÁLISIS Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado radioactivamente y anticuerpo para ese antígeno, produciéndose la reacción. Se determina la radioactividad 1 – 10 ng/ml INICIO

BIBLIOGRAFÍA Jay J., Loessner M., Golden D. 2005. Modern Food Microbiology. 7ª edición. Editorial Food Science Text Series. U.S.A. http://chilealimentosinocuos.blogspot.com/2009/07/analisis-de-toxinas-de-fusarium.html Pagina de Internet consultada el 12 de Febrero 2011. Detección de la desoxirribonucleasa termoestable (termonucleasa) directamente en el alimento. Documento en línea disponible en: http://bvs.sld.cu/revistas/ali/vol10_2_96/ali05296.htm Consultado el día 12 de Febrero 2011. http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_agronomia/5._Metabolitos_Secundarios.ppt Consultado el día 11 de Febrero 2011. http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/ByMInd/Documentos/apoyo/02-BMIndMet.ppt Consultado el día 11 de Febrero 2011.