VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Virus ADN,8.000 pb, familia Papillomaviridae, grupo Papoviridae - Tropismo por epitelio queratinizado - Muy específicos de especie: humanos y animales Genoma circular de doble hélice - Genes tempranos (E1,E2,E4-E7) - Genes tardíos (estructurales): proteínas L1 y L2 Cápsula sin envoltura - Proteína mayor L1 (inmunógena) - Proteína menor L2 Se clasifican en tipos en base a una diferencia de al menos un 10% en la secuencia genética de L1 - Se conocen más de 100 genotipos La infección por el VPH se considera causa necesaria del cáncer de cérvix.

CLASIFICACIÓN PATOGÉNICA DE LOS TIPOS DE VPH Afinidad por la piel: VPH cutáneos: Lesiones verrucosas de la piel Verrugas cutáneas y plantares (papilomas) Epidermodisplasia verruciformis Afinidad por las mucosas: VPH mucosos: 40 tipos Bajo riesgo oncogénico: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 67, 69, 70, 71, 72, 81, 84, 89 Verrugas genitales (condilomas acuminados) Displasia cervical de bajo grado (no evolutiva) Papilomatosis respiratoria recurrente Amb el següent esquema, es mostra com la infecció pel VPH pot fer que un teixit normal pugui passar a teixit amb lesions preneoplàsiques, i que, posteriorment desenvolupi un càncer de cèrvix. Quan un teixit normal és infectat pel VPH poden passar dues coses. Pot regressar la infecció i el teixit normal no ha sofert cap alteració o, amb la persistència de la infecció pel Virus pot provocar que el teixit normal s’alteri i progressi a teixit preneoplàsic. A partir d’aquí, es pot regressar la infecció i/o la lesió o que aquesta progressi desenvolupant un càncer cervical. Most HPV infections clear within 2 years; the 10% that persist for 2 years are highly linked to precancer. Detection of precancers is delayed by their initially small size and the typically low sensitivity of screening methods. Precancers are usually detected around age 25–30 years (about 10 years after sexual debut) in regions with cytological screening. Adapted from Schiffman and Castle.24 Historia Natural del Cáncer Cervical e implicaciones terapéuticas Infección con VPH: la infección con VPH es muy común entre las mujeres en edad reproductiva. La infección por VPH puede permanecer estable, evolucionar a una displasia o no ser detectada. Manejo: si bien se pueden tratar las verrugas genitales que se producen por VPH, no existe ningún tratamiento para erradicar al VPH. La prevención primaria a través del uso del preservativo ofrece cierto grado de protección. El futuro de todas maneras está en las vacunas profilácticas. Lesión escamosa intraepitelial de bajo grado (LSIL): el LSIL (diagnóstico citológico) o CIN1 (diagnóstico histológico) es generalmente temporal y desaparece con el tiempo. En algunos casos, sin embargo, progresa a lesión intraepitelial de alto grado (HSIL o CIN2-3). El VPH puede producir LSIL/CIN1 dentro de varios meses o años después de que la mujer se ha infectado. Manejo: se recomienda, en general, controlar el LSIL en vez de tratarla, ya que en la mayoría de los casos las lesiones presentan una regresión o no progresan. El 80% de las CIN1 regresan a la normalidad. Lesión escamosa intraepitelial de alto grado (HSIL) : el HSIL (diagnóstico citológico) o CIN2-3 (diagnóstico histológico) , es la verdadera lesión precursora del cáncer de cérvix y es significativamente menos frecuente que el LSIL. El HSIL puede originarse, en algunos casos a partir del LSIL y, en otros, directamente a partir de la infección por VPH. Manejo: es muy importante tratar el CIN2-3, ya que una proporción importante de los casos puede progresar a cáncer. Un20% de las CIN2-3 regresan a la normalidad. Carcinoma invasor: las mujeres con CIN2-3 presentan un riesgo elevado de desarrollar carcinoma invasor de cérvix, lo que es un proceso lento a lo largo de varios años. Manejo: el tratamiento del cáncer invasor requiere de hospitalización, lo que resulta caro y a menudo no tiene buenos resultados. Sistema de Clasificación de Bethesda 2001 La clasificación más reciente de los resultados de la citología cervical es el Sistema de Clasificación de Bethesda 2001 e incluye: células escamosas atípicas de significado incierto (ASCUS = atypical squamous cells of undetermined significance); las lesiones escamosas intraepiteliales de bajo grado (LSIL = low-grade squamous intraepithelial lesions), que su equivalente histológico sería el CIN1; y las lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado (HSIL = high grade squamous intraepithelial lesions) que incluyen las histologías de CIN2 y CIN3. Link para ampliar conocimientos: http://bethesda2001.cancer.gov/terminology.html Referencia y resumen editado sobre Bethesda 2001: Solomon D, Davey D, Kurman R, Moriarty A, O'Connor D, Prey M, Raab S, Sherman M, Wilbur D, Wright T Jr, Young N. The 2001 Bethesda System: terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA. 2002 Apr 24;287(16):2114-9. This publication presents the new 2001 Bethesda System terminology for reporting results of cervical cytology and updates the previous 1991 Bethesda System. A new approach was used to broaden participation in the consensus process. Literature review, expert opinion, and input from an Internet bulletin board were all considered in developing recommendations. The proposed system differs with regard to reporting equivocal results. First, “atypical squamous cells” are now qualified as “of undetermined significance (ASC-US)” or “cannot exclude HSIL” (ASC-H). Second, ASC is not a diagnosis of exclusion; all ASC is considered to be suggestive of SIL and the category of “ASCUS, favor reactive” was eliminated. Other changes were included for specimen adequacy, general categorization and interpretation/result. The 2001 Bethesda System terminology reflects important advances in biological understanding of cervical neoplasia and cervical screening technology. Alto riesgo oncogénico: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 Cáncer cervical Cáncer de ano, vagina, vulva, pene Cáncer orofarígeo De probable alto riesgo oncogénico: 26, 53, 66, 68, 73, 82 Relación genética entre los virus oncogénicos más frecuentes: Especie A9:16, 31, 33, 35, 52, 58 Especie A7: 18, 39, 45, 59

VÍAS DE TRANSMISIÓN DEL VPH Vías primarias de infección por el VPH Coito vaginal Coito anal Otras vías de transmisión establecidas (poco comunes): Contacto oral-genital Contacto digital-genital Otras vías no establecidas pero plausibles: Uso compartido de objetos en contacto con el área ano-genital La infección genital no implica necesariamente relación sexual, pero la mayoría se relacionan con sexo sin preservativo. Dinámica de la transmisión sexual (Nº parejas, Temporalidad relación, Patrón apareamiento concordante edad, Diferencias de género, Factores protectores)

PREVALENCIA DE LA INFECCIÓN EN ESPAÑA CastellsaguéX et al. Human Papillomavirusand Related Diseases in Spain. PREHDICT edition. Summary Report 2013. CastellsaguéX et al. TheCLEOPATRE studyJ. Med. Virol. 2012

INFECCIÓN POR VPH CIN= Neoplasia Intraepitelial Cervical (-1,-2-3) HSIL= Lesiones Intrapiteliales Escamosas de Alto grado (CIN-2,CIN-3) LSIL= Lesiones Intrapiteliales Escamosas de Bajo grado (CIN-1) AIS= Adenocarcinoma in situ / Adenocarcinoma invasivo ASCUS= Atipia de Células Escamosas de Significado Incierto AGUS= Atipia de Células Ganglionares de Significado Incierto

INFECCIÓN POR VPH 2.000 16.000 ASCUS/LSIL (2) 497.000 655.000 Impacto del VPH y SIL en España (1996-2000) Cáncer invasor (1) 2.000 HSIL (3) 16.000 ASCUS/LSIL (2) 497.000 VPH + (2) 655.000 MUJERES (1) (15 - 74 años) 15.640.000 (1) Estimación basada en Globocan 2000. (2) Estimación basada en estudios de población general estratificados por edad en 2 áreas urbanas de Cataluña (rango: 2-7%). (3) Estimación de un 0.1% de prevalencia de HSIL basado en (2)

INFECCIÓN POR VPH Sylvia MichelinaFernandes Brenna; Kari Juhani Syrjänen Sao Paulo Med. J. vol.121 no.3 Sao Paulo  2003

ESTRUCTURA GENÓMICA DEL VPH Consta de varios genes u “Open Reading Frames” (ORF) de dos tipos diferentes: Hasta 8 genes de expresión temprana o “early” (E1-E8) cuya expresión se traduce en proteínas para la regulación y replicación viral Los genes de expresión temprana “Early” presentan secuencias muy variables por lo que se han utilizado para la detección específica del tipo. genes E6 y E7: oncogenes que interactúan con pRB y p53, moléculas de control del ciclo celular. 2 genes de expresión tardía o “late” (L1, L2) que generan las proteínas para la unión de la cápside. Son inmunogénicos. Los genes de expresión tardía “Late” presentan secuencias muy semejantes entre los diferentes tipos de VPH. gen L1 principal diana “consenso” de detección Una región URR ó LCR que controla la expresión de los genes tempranos E6 y E7

INFECCIÓN POR VPH La integración aumenta el riesgo de cáncer - I p53 Forma del VPH en la célula Efecto Expresión del gen E6 controlada por E2 La expresión de E6 deja de estar controlada Bloqueo de la actividad de p53 Resistencia a la apoptosis Aumento de la inestabilidad cromosómica Episoma E6 p53 PA Después de la integración Asociación de E6 con p53 y PA

La integración aumenta el riesgo de cáncer - II INFECCIÓN POR VPH La integración aumenta el riesgo de cáncer - II Forma del VPH en la célula Efecto Expresión del gen E7 controlada por E2 La expresión de E7 deja de estar controlada Generación de múltiples cromosomas Inmortalización celular Oncogénesis Episoma E7 pRB E7 es una proteína transformadora importante, capaz de inducir la inmortalidad celular y la oncogénesis.1 Cuando el genoma del virus del papiloma es un episoma, la expresión de E7 está estrechamente controlada por la proteína E2.1 Cuando el genoma del virus del papiloma se integra en el ADN huésped, desaparece la función del gen E2 y la expresión del gen E7 deja de estar controlada.1 Los niveles de la proteína E7 aumentan al desaparecer el control de su expresión. La proteína E7 forma complejos con otras proteínas celulares, como la proteína del retinoblastoma (pRB).2 La asociación de E7 con pRB produce la disociación del complejo pRB/E2F.1 Las moléculas libres de E2F actúan como activadores de la transcripción, estimulando la transcripción de los genes de respuesta a E2F. Esto hace que la célula avance en su ciclo celular.1 E7 también interacciona con las proteínas p107 y p130, que normalmente inhibirían la expresión de pRB.1 Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46. Zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer. From basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer. 2002;2:342–350. + E2F Después de la integración Libre Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.

HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN POR VPH Epitelio Normal Infección VPH CIN1 CIN2 CIN3 Meses Décadas Años LSIL HSIL CIN= Cervical Intraepithelial Neoplasia SIL= Squamous Intraepithelial Lesion Inicio actividad sexual 10-15 años 80% 20% Ca. Cérvix Amb el següent esquema, es mostra com la infecció pel VPH pot fer que un teixit normal pugui passar a teixit amb lesions preneoplàsiques, i que, posteriorment desenvolupi un càncer de cèrvix. Quan un teixit normal és infectat pel VPH poden passar dues coses. Pot regressar la infecció i el teixit normal no ha sofert cap alteració o, amb la persistència de la infecció pel Virus pot provocar que el teixit normal s’alteri i progressi a teixit preneoplàsic. A partir d’aquí, es pot regressar la infecció i/o la lesió o que aquesta progressi desenvolupant un càncer cervical. Most HPV infections clear within 2 years; the 10% that persist for 2 years are highly linked to precancer. Detection of precancers is delayed by their initially small size and the typically low sensitivity of screening methods. Precancers are usually detected around age 25–30 years (about 10 years after sexual debut) in regions with cytological screening. Adapted from Schiffman and Castle.24 Historia Natural del Cáncer Cervical e implicaciones terapéuticas Infección con VPH: la infección con VPH es muy común entre las mujeres en edad reproductiva. La infección por VPH puede permanecer estable, evolucionar a una displasia o no ser detectada. Manejo: si bien se pueden tratar las verrugas genitales que se producen por VPH, no existe ningún tratamiento para erradicar al VPH. La prevención primaria a través del uso del preservativo ofrece cierto grado de protección. El futuro de todas maneras está en las vacunas profilácticas. Lesión escamosa intraepitelial de bajo grado (LSIL): el LSIL (diagnóstico citológico) o CIN1 (diagnóstico histológico) es generalmente temporal y desaparece con el tiempo. En algunos casos, sin embargo, progresa a lesión intraepitelial de alto grado (HSIL o CIN2-3). El VPH puede producir LSIL/CIN1 dentro de varios meses o años después de que la mujer se ha infectado. Manejo: se recomienda, en general, controlar el LSIL en vez de tratarla, ya que en la mayoría de los casos las lesiones presentan una regresión o no progresan. El 80% de las CIN1 regresan a la normalidad. Lesión escamosa intraepitelial de alto grado (HSIL) : el HSIL (diagnóstico citológico) o CIN2-3 (diagnóstico histológico) , es la verdadera lesión precursora del cáncer de cérvix y es significativamente menos frecuente que el LSIL. El HSIL puede originarse, en algunos casos a partir del LSIL y, en otros, directamente a partir de la infección por VPH. Manejo: es muy importante tratar el CIN2-3, ya que una proporción importante de los casos puede progresar a cáncer. Un20% de las CIN2-3 regresan a la normalidad. Carcinoma invasor: las mujeres con CIN2-3 presentan un riesgo elevado de desarrollar carcinoma invasor de cérvix, lo que es un proceso lento a lo largo de varios años. Manejo: el tratamiento del cáncer invasor requiere de hospitalización, lo que resulta caro y a menudo no tiene buenos resultados. Sistema de Clasificación de Bethesda 2001 La clasificación más reciente de los resultados de la citología cervical es el Sistema de Clasificación de Bethesda 2001 e incluye: células escamosas atípicas de significado incierto (ASCUS = atypical squamous cells of undetermined significance); las lesiones escamosas intraepiteliales de bajo grado (LSIL = low-grade squamous intraepithelial lesions), que su equivalente histológico sería el CIN1; y las lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado (HSIL = high grade squamous intraepithelial lesions) que incluyen las histologías de CIN2 y CIN3. Link para ampliar conocimientos: http://bethesda2001.cancer.gov/terminology.html Referencia y resumen editado sobre Bethesda 2001: Solomon D, Davey D, Kurman R, Moriarty A, O'Connor D, Prey M, Raab S, Sherman M, Wilbur D, Wright T Jr, Young N. The 2001 Bethesda System: terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA. 2002 Apr 24;287(16):2114-9. This publication presents the new 2001 Bethesda System terminology for reporting results of cervical cytology and updates the previous 1991 Bethesda System. A new approach was used to broaden participation in the consensus process. Literature review, expert opinion, and input from an Internet bulletin board were all considered in developing recommendations. The proposed system differs with regard to reporting equivocal results. First, “atypical squamous cells” are now qualified as “of undetermined significance (ASC-US)” or “cannot exclude HSIL” (ASC-H). Second, ASC is not a diagnosis of exclusion; all ASC is considered to be suggestive of SIL and the category of “ASCUS, favor reactive” was eliminated. Other changes were included for specimen adequacy, general categorization and interpretation/result. The 2001 Bethesda System terminology reflects important advances in biological understanding of cervical neoplasia and cervical screening technology. Producción de virus No producción/ ↓ diferenciación celular

*Adaptado de Schiffman et al. NEJM. 2005 HISTORIA NATURAL PATOLOGÍA ONCOLÓGICA VPH INFECCIÓN VPH Most HPV infections clear within 2 years; the 10% that persist for 2 years are highly linked to precancer. Detection of precancers is delayed by their initially small size and the typically low sensitivity of screening methods. Precancers are usually detected around age 25–30 years (about 10 years after sexual debut) in regions with cytological screening. Adapted from Schiffman and Castle.24 Historia Natural del Cáncer Cervical e implicaciones terapéuticas Infección con VPH: la infección con VPH es muy común entre las mujeres en edad reproductiva. La infección por VPH puede permanecer estable, evolucionar a una displasia o no ser detectada. Manejo: si bien se pueden tratar las verrugas genitales que se producen por VPH, no existe ningún tratamiento para erradicar al VPH. La prevención primaria a través del uso del preservativo ofrece cierto grado de protección. El futuro de todas maneras está en las vacunas profilácticas. Lesión escamosa intraepitelial de bajo grado (LSIL): el LSIL (diagnóstico citológico) o CIN1 (diagnóstico histológico) es generalmente temporal y desaparece con el tiempo. En algunos casos, sin embargo, progresa a lesión intraepitelial de alto grado (HSIL o CIN2-3). El VPH puede producir LSIL/CIN1 dentro de varios meses o años después de que la mujer se ha infectado. Manejo: se recomienda, en general, controlar el LSIL en vez de tratarla, ya que en la mayoría de los casos las lesiones presentan una regresión o no progresan. El 80% de las CIN1 regresan a la normalidad. Lesión escamosa intraepitelial de alto grado (HSIL) : el HSIL (diagnóstico citológico) o CIN2-3 (diagnóstico histológico) , es la verdadera lesión precursora del cáncer de cérvix y es significativamente menos frecuente que el LSIL. El HSIL puede originarse, en algunos casos a partir del LSIL y, en otros, directamente a partir de la infección por VPH. Manejo: es muy importante tratar el CIN2-3, ya que una proporción importante de los casos puede progresar a cáncer. Un20% de las CIN2-3 regresan a la normalidad. Carcinoma invasor: las mujeres con CIN2-3 presentan un riesgo elevado de desarrollar carcinoma invasor de cérvix, lo que es un proceso lento a lo largo de varios años. Manejo: el tratamiento del cáncer invasor requiere de hospitalización, lo que resulta caro y a menudo no tiene buenos resultados. Sistema de Clasificación de Bethesda 2001 La clasificación más reciente de los resultados de la citología cervical es el Sistema de Clasificación de Bethesda 2001 e incluye: células escamosas atípicas de significado incierto (ASCUS = atypical squamous cells of undetermined significance); las lesiones escamosas intraepiteliales de bajo grado (LSIL = low-grade squamous intraepithelial lesions), que su equivalente histológico sería el CIN1; y las lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado (HSIL = high grade squamous intraepithelial lesions) que incluyen las histologías de CIN2 y CIN3. Link para ampliar conocimientos: http://bethesda2001.cancer.gov/terminology.html Referencia y resumen editado sobre Bethesda 2001: Solomon D, Davey D, Kurman R, Moriarty A, O'Connor D, Prey M, Raab S, Sherman M, Wilbur D, Wright T Jr, Young N. The 2001 Bethesda System: terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA. 2002 Apr 24;287(16):2114-9. This publication presents the new 2001 Bethesda System terminology for reporting results of cervical cytology and updates the previous 1991 Bethesda System. A new approach was used to broaden participation in the consensus process. Literature review, expert opinion, and input from an Internet bulletin board were all considered in developing recommendations. The proposed system differs with regard to reporting equivocal results. First, “atypical squamous cells” are now qualified as “of undetermined significance (ASC-US)” or “cannot exclude HSIL” (ASC-H). Second, ASC is not a diagnosis of exclusion; all ASC is considered to be suggestive of SIL and the category of “ASCUS, favor reactive” was eliminated. Other changes were included for specimen adequacy, general categorization and interpretation/result. The 2001 Bethesda System terminology reflects important advances in biological understanding of cervical neoplasia and cervical screening technology. CÁNCER PRE-CÁNCER 15 30 45 60 Edad (años) *Adaptado de Schiffman et al. NEJM. 2005

HISTORIA NATURAL PATOLOGÍA ONCOLÓGICA POR VPH

INFECCIÓN POR VPH 93,9% 72,4%

PREVENCIÓN DEL CÁNCER DEL CÉRVIX BASADA EN EL HPV Factor de riesgo: VPH Lesiones pre-neoplásicas Cáncer invasivo de cérvix Muerte ESTADÍOS PREVENCIÓN PREVENCIÓN 1ARIA: VACUNACIÓN ANTI-VPH PREVENCIÓN 2ARIA: DETECCIÓN VPH Vaccine, Vol 24 Supplement 3, 2006. © 2006 Elsevier Limited. All rights reserved. Chapter 20, Figure 1 The recognition of the central role of HPV infections in the etiology of virtually all the cervical cancers has dramatically changed the perspectives of the diagnoses and prevention of this neoplasia. The two axes in which this change is being articulated refer to HPV screening and HPV vaccination. Outstanding issues of interest to foster advancements of the preventive applications of HPV technology include research on HPV type-specific distribution in ICC specimens from regions with limited information. This data will allow country policy makers to predict the potential of new prophylactic vaccines against HPV16 and HPV18 in each country, and also will give reliable information on which HPV types should be included in future vaccines and screening techniques. Adaptado de: Chapter 20. Franco EL et al. In: HPV Vaccines and Screening in the Prevention of Cervical Cancer. 2006

*Schiller et al. Vaccine. 2008 VACUNAS VPH - VLP L1 No son infecciosas ni oncogénicas Son altamente inmunógenas Múltiples ensayos clínicos han demostrado alta inmunogenicidad, seguridad y eficacia de las vacunas Mediante recombinación se producen proteínas L1 que se ensamblan simulando el virus. Éstas son casi idénticas a nivel morfológico y antigénico al virus. De ahí su nombre VLP: “Virus Like Particles” The prophylactic vaccines that are currently being used consist of recombinant L1 HPV capsid proteins that are allowed to reassemble into “viral like” particles or VLPs. These viral like particles allow the capsid proteins to been seen by the host’s immune system in the same confirmation as they would be seen in a naturally occurring infection and therefore elicit the correct type of immune response. The VLPs consist of protein only. They lack viral DNA and therefore they are non-infectious and non-oncogenic. The VLPs produce extremely high levels of antibody that is considerably higher than that which occurs in natural infections. It needs to be stressed however, that VLP-based vaccines are only prophylactic, they are not therapeutic and they are not expected to cause regression of established HPV-associated lesions. This diagram summarizes how VLP-based vaccines are made. The first step is to isolate the DNA of a naturally occurring HPV and then clone the gene or open reading frame (ORF) encoding the L1 capsid protein into a plasmid. The plasmid containing the L1 gene is then introduced into a eukaryotic cell, the L1 gene is transcribed into mRNA and the cell then translate the mRNA into L1 capsid proteins. These capsid proteins then combine together to form a viral like particle. Since no viral DNA (except for the L1 gene) has been introduced into the eukaryotic cell, there are no viral genomes available to incorporate with the viral like particles so there is no danger of producing infectious virions. The VLPs are then purified and used to elicit an immune response in the host. *Schiller et al. Vaccine. 2008

*Schiller et al. Vaccine. 2008 VACUNAS VPH - VLP L1 VLPs de L1 de VPHs 6, 11, 16 y 18 Producción: “levaduras” Adyuvante: Aluminio Pauta: 0, 2 y 6 meses (0,5 ml, IM) VLPs de L1 de VPHs 16 y 18 Producción: baculovirus Adyuvante: AS04 Pauta: 0, 1 y 6 meses (0,5 ml, IM) Merck / SPMSD Gardasil® GSK Cervarix® VPH 6, 11, 16 y 18 VPH 16 y 18 Característiques vacunes. *Schiller et al. Vaccine. 2008

VACUNACIÓN FRENTE AL VPH EN ESPAÑA 13 13 42,113 5,450 3,441 5,036 9,902 10,231 2,171 32,050 9,692 5,467 10,237 1,342 27,768 7,321 2,783 434 457 8,036 22,517 CERVARIX GARDASIL 14 14 15 12 2,653 Cuadrados proporcionales a la población a vacunar. Cifra es el num. de niñas con la edad correspondiente* 11 11 Centro salud 14 14 14 Escuela 1,328 14 14 Edad Vacunación 14 14 14 Edad catch-up 14 14 14 14 14 13 14 * INE 2009

PROTECCIÓN CRUZADA DE LAS VACUNAS REVISIÓN DEL PROGRAMA DE VACUNACIÓN FRENTE AL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN ESPAÑA Grupo de trabajo VPH 2012 INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 2013 MINISTERIO DE SANIDAD, SERVICIOS SOCIALES E IGUALDAD Eficacia de la protección cruzada: se mide en función de la protección frente a “enfermedad persistente(>6 meses)” y frente a “CIN2+/AIS” en la población naive de mujeres vacunadas seronegativas y DNA-PCR (-) frente a los genotipos no vacunales individuales (31, 33, 45…) o agrupados. VACUNA BIVALENTE, frente a cualquier otro oncotipo: CIN2+…..64,9% CIN3+…..93,2% VACUNA TETRAVALENTE, frente cualquier otro oncotipo: CIN2+/AIS…42,7% PROTECCIÓN TOTAL (datos conjuntos): 80%.......72,4% oncotipos 16, 18 …….7,6% protección cruzada otros oncotipos

EFECTIVIDAD, EFICACIA, REEMPLAZO Y COSTE-BENEFICIO Efectividad comprobada hasta 6 años, permite estimar una efectividad permanente. Seguimiento eficacia: ↓CIN2+/infección persistente//efectividad títulos Ac/sero+ Reemplazo oncotipos: No se ha demostrado trs 5 años de seguimiento VPH ha permanecido estable geneticamente durante milenios Poco probable su mutación para adaptarse al nuevo nicho ecológico. Coste-beneficio: precio/dosis 100€……..31€

EVOLUCIÓN TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS VPH Revisión de las pautas de screening Coilocito / Efecto citopatico HPV Dürst et al. 1983 VHP+ 99,7% Cánceres de Cérvix1 P16 CINTec Cervatec p16 ELISA L1Ag Cytoactiv ONCOTEC mRNA E6/E7 Screening 1º basado en DNA HPV LBC:Citología líquida ThinPrep® SurePath® Test de Papanicolau 2000s PCR 1990s LBC 1949 1980 1996 1999 2003 2008 Prevención Secundaria Prog. Base Poblacional Finlandia 1963-2008 HC-2 / H Ventana Amplicor* Roche DNA Invader* WD PREVENCION PRIMARIA ESCENARIO POSTVACUNAL 1Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado )

MÉTODOS DE DETECCIÓN DEL VPH Citología Papanicolau / citología líquida Automatización de la lectura. Colposcopia / Microcolposcopia Colposcopia computarizada Métodos moleculares basados en la detección de ADN / RNA viral Métodos basados en la detección de patrones de expresión de proteínas: p16 INK4 CERVATEC-ELISA / Cit/ Tej. Métodos SEROLOGICOS de detección de Ac. contra HPV

MÉTODOS MOLECULARES DETECCIÓN ADN VPH 1- Hibridación in situ (ISH), Hibridación de DNA Disponible en prueba coktail. 2- Hibridación seguida de “amplificación de la señal” Hybrid Capture 2 (HC2 R ,Qiagen): RNA probe Coktai Invader Tecnology: Third Wave invader HPV test Hibridación ADN/ARN. Cóctel de sondas: Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44. Sensibilidad adecuada a procesos de cribado de VPH (1 pg/mL). Aprobado por la FDA. Posibilidad de semicuantificar. Estandarizada y automatizable. Detecta de forma cruzada otros genotipos. LIMITACIONES: Prueba dependiente del estado de conservación del DNA viral La semicuantificación de la Carga Viral solo indica el nº de copias No distingue los diferentes tipos virales No detecta infecciones múltiples Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos virales de bajo riesgo. La mayoría de las muestras discordantes HCII+ están relacionadas con un valor bajo de RLU y reactividad cruzada con genotipos de bajo riesgo

MÉTODOS MOLECULARES DETECCIÓN ADN VPH 3- PCR multiplex: “Amplificación de DNA con primers consenso” Real time HR-HPV ( Aboot) AMPLICOR R ( Roche) • Es la técnica molecular más sensible y flexible. • Puede ser utilizada para la detección, la cuantificación, la secuenciación y el análisis mutacional. • La cuantificación del producto resulta compleja (estándares internos). • Exige del laboratorio y del personal una normas y unas condiciones especiales.

DETECCIÓN DEL VPH: GENOTIPADO

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH PCR Primers de consenso GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11 primers específicos Hibridación reversa RFLP Secuenciación Array PCR en tiempo real

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH Hibridación reversa LIPA (INMUNOENSAYO LINEAL) • Amplifica pequeños fragmentos de 65 bp en la región L1 (primers SPF). • Detecta 25 tipos de VPH e infecciones múltiples. LINE-BLOTTING (PGMY-LB) • Amplifica la región L1 con mezclas de primers (PGMY09/PGMY11) y el gen de la betaglobina humana, ambos biotinados. • El producto amplificado se hibrida con sondas de 37 tipos de VPH fijadas a una membrana de nitrocelulosa. (Kleter et al. J Clin Microbiol 1999; 37: 2508-17. Gravitt et al. J Clin Microbiol 1998; 36: 3020-7. Kornegay et al. J Clin Microbiol 2003; 41: 1080-6. Van Hamont et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3122-9.) 0,79 Valor kappa 8,2 Discordancia 11,2 Compatibilidad 80,6 Concordancia LIPA Vs. LINE-BLOTTING

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH RFLP (patrón de restricción con endonucleasas) • Método que permite combinar la sensibilidad de la PCR con el poder discriminatorio de las endonucleasas de restricción. • Es un sistema poco laborioso y menos costoso que LIPA y secuenciación. • Resulta difícil detectar infecciones mixtas. Bernard et al. J Infect Dis 1994; 170: 1077-85. Wang et al. J Med Virol 1999; 59: 536-40. Kay et al. J Virol Meth 2002; 105: 159-70.

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH Hibridación con microarrays • Tras una PCR de la región L1, que marca el producto amplificado, se hibrida con oligonucleótidos dispuestos en microarray. • Se generan sondas a cada tipo de VPH y se fijan a los pocillos de reacción. • Se amplifica la muestra con primers genéricos marcando con Cy5 el producto amplificado. • Hibridación y lectura. (An et al. Cancer 2003; 97: 1672-80. Oh et al. J Clin Microbiol 2004; 42: 3272-80. Gheit et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 2025-31.)

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH Secuenciación de ADN La secuenciación de Sanger se basa en la polimerización del ADN y el uso de dideoxinucleótidos que sirven como terminadores de la reacción. En la actualidad la reacción de secuenciación se basa en una modificación de la PCR con dideoxinucleótidos marcados con fluoróforos y se resuelve mediante una electrofoesis capilar. La información obtenida en los secuenciadores automáticos se guarda en ficheros binarios que incluyen un cromatograma.

ESTRATEGIAS DE GENOTIPADO DE VPH RealTime-PCR   Real Time PCR (RT-PCR) permite controlar el progreso de la reacción de PCR a medida que esta ocurre. El RT-PCR usa marcado fluorescente para monitorear la amplificación de productos durante cada ciclo de reacción (detección de la cinética de la reacción). Esta técnica combina los pasos de amplificación de ADN y la detección en un único ensayo. La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN amplificado

Amplificación de la diana SENSIBILIDAD + - Hibridación in situ Southern blot real time PCR HC II PCR Sonda directa Señal amplificada Amplificación de la diana

ADN-VPH EN CÁNCER CERVICAL Evolución de la tecnología diagnóstica del VPH y relación de causalidad con el cáncer de cérvix ADN-VPH EN CÁNCER CERVICAL 30%-60% 75% 95% 99% SENSIBILIDAD - + SOUTHERN FISH TESTS PARA LA DETECCIÓN DE ADN-VPH TS.PCR; L1.PCR GP.PCR HC I HC II HC III realtime-PCR 1980 1990 2000 (Bosch et al. J Clin Pathol 2002; 55: 244-65.)

RECOMENDACIONES DE CRIBADO Oncoguía SEGO Prevención del Cáncer de Cuello de Útero 2014

UTILIDAD DE LOS TEST VPH-ADN Hibridación In situ (ISH) PCR Captura Híbrida 2 (HCII, Digene) Valor predictivo negativo Si test VPH positivo , NO significa que desarrollará cáncer, la mayoría de mujeres que están infectadas no lo desarrollan Si test VPH negativo, es muy difícil que se desarrolle el cáncer El verdadero valor del test está en muestras negativas (Cribado 3 a 5 años) Sólo detectan infecciones muy prevalentes, de las cuales 70% de las infecciones desaparecen en 1 año, y un 91% en dos años (sin ningún tipo de tratamiento) Sólo las infecciones persistentes tienen riesgo de desarrollar lesiones precancerosas de alto grado y cáncer ( aprox. 10% de mujeres con el virus.) Por tanto, estos tests presentan limitaciones que las tecnología basada en la determinación de proteínas virales pretende resolver

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Determinación de la carga vírica No se correlaciona bien con el nivel de lesión histológica. Hay que distinguir la alta carga vírica previa al aclaramiento del virus y la que es consecuencia de la persistencia del virus. Únicamente se ha demostrado que tiene valor en las infecciones simples por HPV 16. Gravitt et al., Int J Cancer, 2007,121,2787. Briolat et al., Int J Cancer, 2007,121,2198.

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Carga viral total / Carga viral relativa CVR= CVT : nº cel.

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Integración del ADN vírico en el cromosoma celular • La integración del ADN vírico conduce a la sobreexpresión de E6 y E7 • Utiliza técnicas de hibridación in situ (FISH) con sensibilidad incrementada (HPV-CARD) • El ADN integrado ó episómico presenta diferentes patrones de visualización Algeciras-S

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Detección de ARNm de E6/E7 del VPH • La expresión de E6 y E7 puede medirse por sus niveles de ARNm. • Es un marcador indirecto de integración vírica. et al. Gynecol Oncol 2005; 97: 908-15.) • Tiene mayor valor predictivo positivo que otras técnicas moleculares en lesiones de bajo grado. • Existen comercializadas en formato de NASBA y FISH.

MÉTODOS PREDICTORES DE PROGRESION Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: PreTect HPV- Proofer HPV Oncotect

SIGNIFICACIÓN DIAGNÓSTICA TEST VPH-ADN Hibridación In situ (ISH) Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) Captura Híbrida 2 (HCII, Digene/Quiagen) La mujer no se encuentra infectada por VPH. Es muy difícil que se desarrollen lesiones severas o cáncer Alto Valor predictivo negativo (VPN) (cribado 3 a 5 años) VPH negativo La mujer esta infectada por VPH NO significa que desarrollará cáncer, la mayoría de mujeres que están infectadas no lo desarrollan Bajo Valor predictivo positivo (VPP) Un 90% de las infecciones se aclaran en 2 años VPH positivo

SIGNIFICACIÓN DIAGNÓSTICA TEST VPH-ARNm HPV OncoTect No hay expresión de oncoproteínas Aunque el virus este presente no hay actividad oncogénica HPV OncoTect negativo Alto Valor predictivo negativo (VPN) Presencia de oncoproteínas en el exocervix. Existe actividad celular anormal, integración viral y alta probabilidad de progresión. HPV OncoTect positivo Alto Valor predictivo positivo (VPP) Alta correlación con progresión

UTILIDAD CLÍNICA ARNm-VPH VPH ARNm E6/E7 como marcador clínico para la detección precoz del cáncer de cérvix1: detección de VPH mRNA E6/E7 indica la actividad oncogénica del VPH y no sólo la presencia de una infección frecuente (tests de VPH ADN) Es el indicador clínico más relevante para el desarrollo del cáncer de cérvix, y puede ser usado como un marcador clínico predictivo para identificar aquellas mujeres con riesgo alto de desarrollar lesiones displásicas de alto grado y cáncer Debido a la integración del VPH y la fragmentación del ADN, en muchos casos los tests basados en detección de ADN darán resultado negativo 2: 4-25% casos Sería un método de cribado ideal³ aquel que incidiera en la detección de la transcripción activa de oncogenes VPH-AR o de las proteínas resultantes de su expresión (1) HPV HandBook: "Human Papillomavirus and Cervical Cancer", edited by Professor Walter Prendiville and Dr Philip Davies, supports detection of oncogenic activity (page 75 and 76): (2) Sankaranaryanan et al., Accuracy of human papillomavirus testing in primary screening of cervical neoplasia: results from a multicenter study in India. International Journal of Cancer 112: 341-347, 2004 (3) Documento de consenso SEGO: “La infección por papilomavirus”.

MÉTODOS BASADOS EN LA DETECCIÓN DE PATRONES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS Cervatec TM p16INK4a ELISA Es un ensayo Sanndwich con enzimas unidas a un inmunoadsorvente. El dispositivo de inmunoensayo está basado en el uso de Ac. monoclonales específicos marcados con cromógeno para p16 ( la proteína solubilizada de muestras cervicales lisadas en pocillos de microplacas). Se obtiene una señal cromogénica proporcional a la concentración de p16. El kit ELISA proporciona los reactivos para la estandarización de la señal del ensayo así como los controles apropiados.

p16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytology SCORE 1 SCORE 2 Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7

p16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytology SCORE 3 SCORE 4 Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7

Infección HPV Persistente Expresión de P16 Infección HPV Infección HPV Persistente Desregulación Celular CIN Alto grado Cancer Invasivo HPV test (PCR) Nuevo biomarcador (p16INK4a ) Citología Individuos en riesgo Pacientes con Enfermedad

ALGORITMO FRENTE A CRIBADO POSITIVO Oncoguía SEGO Prevención del Cáncer de Cuello de Útero 2014

INFECCIÓN POR VPH

POSITIVE CELLS Criteria for assessment of p16 INK4 a Nuclear size and nuclear-cytoplasmic ratio: nucleus significantly enlarged >50% Hipercromasia and nuclear texture: coarse and inhomogeneous cromatin Nuclear shape and membrana structure: Irreg. of the nuclear shape/or border. Anisonucleosis Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7

SIGNIFICACIÓN DIAGNÓSTICA TEST VPH-ARNm HPV OncoTect No hay expresión de oncoproteínas Aunque el virus este presente no hay actividad oncogénica HPV OncoTect negativo Alto Valor predictivo negativo (VPN) Presencia de oncoproteínas en el exocervix. Existe actividad celular anormal, integración viral y alta probabilidad de progresión. HPV OncoTect positivo Alto Valor predictivo positivo (VPP) Alta correlación con progresión

La CARGA VIRAL Y LA INTEGRACION valor en la predicción de Progresión PCR a tiempo real: Asigna valores cuantitativos reales a los amplificados Usa sondas específicas marcadas con fluorocromos (Taqman, Scorpions) Se mide la excitación lumínica ciclo a ciclo ( Laser + Cámara CCD) Análisis de regresión de las variaciones de niveles lumínicos con elaboración de línea gráfica donde extrapolar los valores iniciales cuantitativos para cada gen estudiado. Carga viral: Permite la comparación de las cantidades de un determinado gen viral con un gen celular constitutivo. Permite determinación de CV Total Determinación de CV Relativa: CVR = CVT : nº de cel. ( Gen Constitutivo) Estado de integración: Análisis de la proporción de E6-7 con el gen susceptible de pérdida de E2 ,Episomal: E6-7 = E2 Integración total: E2 = 0 Formas episomales e integradas: E6-7> E2

INFECCIÓN POR VPH

ALGORITMO FRENTE A CRIBADO POSITIVO Oncoguía SEGO Prevención del Cáncer de Cuello de Útero 2014

RECOMENDACIONES DE CRIBADO Oncoguía SEGO Prevención del Cáncer de Cuello de Útero 2014

Proposed new screening algorithm Women aged 25-64 y HPV Test Negative Positive Normal 5 year recall CYTOLOGY Normal or Borderline =/> Mild HPV test and Cytology at 6-12 months Colposcopy HPV+ and Cyto >mild HPV – and Cyto Borderline Cyto=/> Mild Cyto Neg HPV Neg Normal 5 Year Recall Colposcopy HPV and Cytology at 6-12 months EUROGIN November 2008

INFECCIÓN POR VPH

Tests de detección de RNA Métodos de amplificación de RNA isotérmicos PreTec HPV-Proofer ( Norchip): 5 genotipos HR-HPV APTIMA GenProbe: 13 Genotipos HR-HPV. Detección mRNA sin destrucción celular: ONCOTEC Hibridación in situ con fluoresceina ( FISH)+ citometría de flujo

INFECCIÓN POR VPH

Tecnología aplicada en el Estudio CERVATEC Cervatec TM p16INK4a ELISA Es un ensayo Sanndwich con enzimas unidas a un inmunoadsorvente. El dispositivo de inmunoensayo está basado en el uso de Ac. monoclonales específicos marcados con cromógeno para p16 ( la proteína solubilizada de muestras cervicales lisadas en pocillos de microplacas). Se obtiene una señal cromogénica proporcional a la concentración de p16. El kit ELISA proporciona los reactivos para la estandarización de la señal del ensayo así como los controles apropiados.

HISTORIA NATURAL INFECCIÓN POR VPH La infección por HPV-HR produce una lesión morfológíca con fuerte tendencia a la regresión y muy baja a la progresión ( Moscicki 2004; Castle 2005) La resolución de la infección confiere inmunidad. Una infección posterior por el mismo genotipo debe atribuirse a una reactivación de una infección latente = explicar el aumento de prevalencia en mujeres >60 años ( Silvia de Sanjosé 2006) En el proceso de carcinogénesis los eventos moleculares no se correlacionan con las categorias morfológicas. ( Gran variabilidad interobservador del CIN II) La probabilidad de que un HSIL regrese a LSIL es 3 veces mayor de que suceda lo contrario. (Cantor et al 2005) Pueden aparecer lesiones de alto grado en ausencia de LSIL. (Schiffman et al 2005) La carcinogenesis precisa de una infección persistente Inf. 7-15 a. CIN III 10 a. C. E. I. ( Bosch y Sanjose , 2003)

CÉLULAS exocervicales con secuencia diana Método HPV OncoTect CITÓMETRO DE FLUJO HPV E6, E7 ARNm+ Cels (%) ARNm - Cels CÉLULAS exocervicales con secuencia diana Etiqueta anticuerpos ARNm E6/E7 Fluorocromo unido a sonda de ADN complementaria a ARNm FIJAR/ PERMEABILIZAR (R1, R2, R3) + CALOR/LAVADO (R6/R7) OLIGONUCLEÓTIDOS marcados con fluorocromo (R5) PMNs Células endocervicales Células exocervicales Debris ATTAGAAT

Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: PreTect HPV- Proofer • Amplificación de diana ARN (NASBA) • Utiliza sondas específicas (molecular beacons) • Determina 5 genotipos: 16, 18, 31, 33 y 45 • Correlaciona con otros marcadores de progresión histológicos (p16INK) pero no con la carga vírica. Molden et al., J Virol Meth, 2007,142,204. Andersson et al., Int J Oncol, 2006,29,705

Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: HPV Oncotect • Técnica de FISH • Directamente de citología líquida. • Se realiza en menos de 3 horas • Lectura en citómetro de flujo • En muestras de LSIL: - Sensibilidad 83.3% - Especificidad 91.3% Narimatsu y Patterson, Am J Clin Pathol,2005,123,716.

INFECCIÓN POR VPH

Determinación de p16: Citologías y Biopsias: Aumenta la concordancia inter-observador Aumenta la sensibilidad y especificidad de los resultados respecto de HC-II para detectar lesiones de alto grado (HSIL). Fluido vaginal: Cervatec p16 ELISA Estudio CERVATEC. Conclusiones preliminares: Alta sensibilidad (93%) para identificación de HSIL en mujeres < 35 años Especificidad del (92%) La especificidad se incrementa al 97% cuando se combina con test de HPV