Pasantía en Rosario Diciembre 2007-Febrero 2008

Presentación del Modelo Trypanosoma cruzi y sus particularidades

Enferemdad de Chagas Varios millones de personas afectadas Agente causante: T. cruzi

Estabilidad del Mensaje - Movilización Expresión génica gen A gen B gen C gen D gen E gen D ADN Transcription ARN policistronico Trans-splicing Poli adenilación ARNm individual AAAAA Estabilidad del Mensaje - Movilización AAAAA … Traducción AAAAA Modificaciones

Importancia de la regulación post-transcripcional Estabilidad Traducción Cambios rápidos en la expresión génica Proteínas de unión al ARN (UTR’s) Familia Pumilio Drosophila Estabilidad y traducción Dominio conservado de interacción Estudios en levadura 10 miembros en T. cruzi TcPuf6

Antecedentes de la pasantía

TcPuf6 No esencial para el crecimiento Sobreexpresión en T. brucei reduce infectividad Expresión constitutiva

Mensajeros asociados a TcPuf6

Interacción entre TcPUF-6 y TcDdh1

Objetivos

Demostrar la unión de la proteína homologa a Pop2 en T Demostrar la unión de la proteína homologa a Pop2 en T. cruzi a TcPuf6 por medio de ensayos de Y2H Clonar (y expresar) dicha proteína para continuar con su caracterización

Procedimiento experimental

Doble híbrido en levadura

Resultados

Doble híbrido en levadura pEntr-pop2 pEntr-puf6 Clonasa pGad-pop2 pGbk-pop2 pGad-puf6 pGbk-puf6

Cotransfecciones relevantes Para ver interacción: pGad-pop2/pGbk-puf6 pGad-puf6/pGbk-pop2 Controles de auto-activación por pop2: pGbk-pop2/pGad-T7 pGad-pop2/pGbk-T7 Controles de auto-activación por puf6: pGbk-puf62/pGad-T7 pGad-puf6/pGbk-T7 Control negativo pGad-T7/pGbk-T7 Cotransfección de ambas fusiones Cotransfección con un vector vacío Cotransfección con ambos vectores vacios

Master Plates (-LT)

Controles autoactivación pGBK -LT -ura -his 50mM 3AT

Placas –LT –H 3AT pGBK-Puf/pGAD-pop

Placas –LT –Ura pGBK-Puf/pGAD-pop

Método de las diluciones -LT –LT –Ura –LT –His 50mM3AT Cont Gad Cont - Cont Gbk Gbk-pop/ Gad-puf

Producción de proteína recombinante en E. coli pEntr-pop2 Clonasa pDest-pop2 pGex-pop2

Inducción con 1mM IPTG S/ind His Gst MW Pop-gst??

Concluisones Se logro clonar TcPop2 Existe una interacción entre TcPuf6 y TcPop2 en este sistema Podríamos tener un sistema de sobreexpresión de TcPop2-Gst para continuar con la caracterización del sistema

Cosas pendientes Controles… Purificar TcPop2 Validar en un segundo sistema la interacción encontrada (Anticuerpo)