TRANSCRIPCIÓN EN TRIPANOSOMÁTIDOS 2007

Transcripción en Tripanosomátidos 4 ARN polimerasas (I, II y III; y mitocondrial) Factor universal de transcripción relacionado con TBP (TRF4: TBP related factor 4) Organización general de genes: policistrónica (no relacionados funcionalmente) “Capping” de ARNm (por trans-splicing) La regulación post-transcripcional es la clave para los cambios en la expresión génica Esta regulación se ejerce a través de elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR)

ARN polimerasa III Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs y snARN) usando snARN Básicamente presenta los mismos promotores que eucariotas superiores: estar tanto en la región 3’ como 5’ ? ? ? Tipo 3 A C Tipo 1 B Tipo 2 Punto de inicio ARNr 5S ARNt U1-U5 (diferencia con eucariotas sup)

Upstream control element ARN polimerasa I Transcribe ARN ribosomal (nucleolo) y además, transcribe 2 grupos de genes que incluye Ags de superficie (VSG y PRO) Los transcriptos ARNr no se le agrega cap: 20% 5’ tri-PO4 y 80% 5’ OH La estructura del promotor es semejante a los otros eucariotas: bipartita Core promoter Punto de inicio –170 –150 –130 –110 –60 –40 –20 –10 +10 +20 Upstream control element Pol I

Promotores de ARN Pol I Similar a los promotores de ARNr euc. superiores Aparentemente están siempre activos (la regulación para las unidades de VSG y de PRO es en la elongación). Core Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5’ (UCE) Suficiente para transcribir VSG

Mitocondrial transcripción: ARN polimerasa mitocondrial (mitARNpol) Nota: El ADN en el kinetoplasto está distribuído en: maxi- y mini- círculos 30-50kb 0.8-1.6 kb 10-30 copias 30000-50000 copias genoma mitocondrial ARNguias No se han encontrado secuencias promotoras consenso mitARNpol es transcripta en el núcleo como una única subunidad Nota: los ARNt del kinetoplasto se transcriben en el núcleo y se deben importar

ARN polimerasa II (presenta dominio CTD) Es responsable de la transcripción de genes estructurales (actina y tubulina), de los genes del miniexon (ARN-ME o SLRNA) y otros snARN Bajo nº de promotores y diferentes a otros eucariotas No hay gran regulación en el inicio de la transcripción Expresión constitutiva Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T.brucei, T.cruzi) Transcripción policistrónica la finalización de la transcripción al final del policistrón no está caracterizada aún mRNA maduro monocistrónico: capping, poli(A)

Promotores de ARN Pol II Como no existen evidencias de promotores clásicos de ARN pol II, se ha sugerido que inicia la transcripción al azar Se conoce: -Secuencias consenso en promotores para miniexon -Proteínas de unión a promotor del miniexon Los promotores se encuentran en el 5’ de cada copia (bipartita) Pol II SL-RNA T...T -60 -30 PBP2 PBP1 3 subunidades una TBP-like Evidencia que recluta la pol II Finalización? (semejante a bacteria: rho-independiente)

Procesamiento del pre-ARNm / Trans-splicing Todos los ARNm estudiados comienzan con la misma secuencia de 30-40 nt -> miniexon (ME - SL) Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está siendo analizado Existen 100-200 genes para ME por núcleo en tandem c/u está presente en un repetido de aprox 1,3 kb Su transcripto presenta Cap 4 (m7G, metilaciones 2’OH ribosas 1-4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónico

El trans-splicing es un mecanismo utilizado para generar ARNm maduro para ser exportado del núcleo ADN

trans-splicing y poliadenilación están acoplados Trans-splicing alternativo: se describió para LYT una proteína de asociada con la virulencia. La diferncia son 28 aa en el N-t: La > es de membr (fase virulenta) la menor está en el kinetoplasto.

Regulación se debe dar luego del inicio de la transcripción Transcripción de genes para proteínas es constitutiva No existen factores que regulen la iniciación de la transcripción Regulación se debe dar luego del inicio de la transcripción Elongación ME/poli(A) 3’UTR traduccional estabilidad de la proteína

transcripto policistrónico Maquinaria de procesamiento de ARNm Podría ser más eficiente si se cambia la elección de un gen en un ARN pre-existente que en el ADN ya que se debe reclutar reguladores específicos (aunque esto implique una gran degradación del transcriptoma) ARN polimerasa encargada de la elongación Control sobre secuencias intergénicas

3’UTR de PRO: Estabilidad / Degradación Factores que regulan la producción de ARNm de PRO también regulan opuestamente el sitio activo de transcripción de la VSG ME AAAAA n 5’ UTR 3’ UTR 37º no-citrato 27º citrato Transcripción basal ME AAAAA n ME AAAAA n AAAA ME AAAA ME Se cree que estos factores externos actúan sobre elementos en el 3’UTR

Editado Modificación de la información génica codificada en el ADN. Se adicionan o se remueven bases del ARNm. Generalmente se introducen o se sacan “U” Se corrige el marco de lectura Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial. Simple: número pequeño de U en el extremo 5´ cox2 en T.brucei Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen > 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox3

Eucariotas inferiores: En mitocondrias de Trypanosoma: la citocromo oxidasa subII (coxII) que tiene insertadas 4 U que cambian aminoácidos y además cambia el marco de lectura. Como no existe otro gen, las U fueron agregadas luego de la transcripción Mecanismo: se encontraron ARN-guías, que contiene una secuencia complementaria del transcripto Acción de la TUTasa usando pool de UTP de la célula Endorribonucleasa y ligasa (ATP)

CARACTERÍSTICAS DE LOS gARN Todos los gRNA tienen su propio gen en el minicírculos mitocondriales (salvo el 3’ de COXII) Son pequeños (40-70nts) y no sufren edición. El extremo 5’ de cada gRNA es complementario a la secuencia cercana a la región editada hacia el 3’ del mRNA. El extremo 3’ de los gRNAs tienen una cola de U (5-15nts), que es agregada por una terminal uridil transferasa (TUTasa). La secuencia intermedia contiene una secuencia que es complementaria a la porción editada del mRNA. (AU, GC y GU)

Algunas consideraciones del editado Armar marcos de lectura: - crear codón de inicio y de terminación, - establecer marcos de lecturas funcionales La edición es esencial para la diferenciación en T. brucei Las cantidades relativas de ARNm editado y sin editar varía en los diferentes estadios (mecanismo de regulación?)

Variación antigénica T. brucei: Inmunofluorescencia de formas sanguíneas usando anticuerpos contra la VSG 221 (verde) o la VSG VO2 (rojo).

Variant surface glycoprotein (VSG) Glicoproteínas variables de superficie que constituyen una cubierta densa e inmunogénica de la membrana plasmática (107 por organismo) Son grandes 450-500kDa Sólo una se expresa por vez El cambio de expresión de VSG se realiza en forma espontánea (1 cada 100 por generación) Existen aproximadamente 1000 potenciales variantes por organismo

Los sitios de expresión están ligados a telómeros Existen aproximadamente 20 sitios de expresión El sitio activo de expresión aparentemente no se encuentra en un cuerpo nucleolar Sólo una se expresa, es decir que sólo se expresa la copia ELC que está localizada en el sitio de expresión que está bien cerca del telómero

Cada cambio se acompaña de un pico de parasitemia Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito, Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización. Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b) a b c d ...etc Copia Básica (BC) Copia ligada a la expresión (ECL) Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL)

Cada VSG es codificado por una copia básica que puede encontrarse a 5-15kb del telómero (teloméricos) o >50kb del telómero (internos) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) Expresión algo programada (aparentemente involucra a la cantidad de repetidos de 70pb)

La formación del ELC ocurre por conversión génica VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(copia-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(tel-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(tel-act) VSG(interno) VSG(tel-inact)

Existen muchas copias del gen VSG en el genoma. La mayoría de los genes VSG son pseudogenes: recombinación puede generar nuevos genes VSG aumentando la variabilidad. Esta nueva información la guarda temporariamente cambiando el sitio de expresión Aparentemente el silenciamiento de los otros sitios de expresión y la recombinación son independientes

3000pb Región transpuesta Repetidos cortos? 8kb 40kb 5’ 3’ TELOMERO VSG 1500pb (CCCTAA)n Otro ejemplo es la bacteria Borrelia hermsii que causa la fiebre recurren-te en el hombre. Esta bacteria sobrevive alterando una proteína de superficie (VMP), que están asociados con rearreglos en el genoma. El gen VMP activo está localizado cerca del telómero de un plásmido lineal.