Técnicas para el estudio de microorganismos del suelo PRÁCTICO N° 1 Técnicas para el estudio de microorganismos del suelo Objetivo: Conocer las técnicas básicas para el análisis microbiológico del suelo Normas prácticas para el muestreo de suelo Técnicas para el cultivo de microorganismos Técnicas de observación al microscopio Métodos de aislamiento y conservación

Normas prácticas para el muestreo de suelo Diseño de muestreo: Cantidad de muestras: topografía y heterogeneidad del lote Forma de muestreo: cultivo, sistema de labranza Profundidad: 0 – 20 cm Acondicionamiento de las muestras Preparación de las muestras en laboratorio

Cantidad de muestras: topografía y heterogeneidad del lote Loma 15 Submuestras = 1 Muestra Medialoma Bajo Agricultura de Precisión Imagen Satelital Mapa de Rendimiento Mapa de Ambientes

Elementos de muestreo Pala Barreno Manual Barreno Hidráulico

Forma de muestreo: cultivo y sistema de labranza Siembra directa Labranza convencional Rastrojo de maíz Rastrojo de soja Suelo laboreado

Forma de muestreo: profundidad 0 cm. 20 cm.

Acondicionamiento de las submuestras ~200 g.

Preparación de las muestras en laboratorio Oreado Mínimo 24 hs. Tamizado Embolsado y Rotulado Conservación

Técnicas para el cultivo de microorganismos Requerimientos para el cultivo de microorganismos en laboratorio: Condiciones de asepsia: esterilización Medios de cultivos Condiciones ambientales

Condiciones de asepsia: esterilización Esterilización: eliminar todos los organismos vivos Métodos de esterilización: Calor: húmedo y seco Radiación Filtración Productos químicos

Calor húmedo: Autoclave Combinación de calor, presión y humedad Para sustancias acuosas Temperatura de esterilización: 121°C - 20 minutos A gas con regulación manual Eléctrica con regulación automática

Calor seco: Horno de esterilización Para materiales estables al calor (vidrio, metal, porcelana etc.) Vista exterior Temperatura de esterilización: 160 °C Tiempo: 2 hs Vista interior

Otros métodos de esterilización Radiación UV: superficies, aire y agua Filtración: soluciones lábiles Filtro Agua Oxigenada Alcohol etílico Hipoclorito Formol Bicloruro de mercurio Productos químicos: mesada, manos, tapones, etc.

Medios de cultivos Definición: mezcla balanceada de requerimientos nutritivos para el crecimiento de microorganismos Tipos: Generales Selectivos Composición química: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, fuente de energía, base mineral y factores de crecimiento Características: líquidos o sólidos: agentes solidificantes

Composición de medios de cultivos Medio selectivo: Fijadores de Nitrógeno Medio general FUENTE COMPUESTO CANTIDAD Fuente de C y energía Sucrosa 20 g Base mineral Fosfato di potásico 0.05 g Fosfato monopotásico 0.15 g Cloruro de calcio 0.01 g Sulfato de magnesio 0.2 g Molibdato de sodio 0.002 g Cloruro férrico Carbonato de calcio 0.1 g Agua Agua destilada 1000 ml pH = 7 FUENTE COMPUESTO CANTIDAD Fuente de C y energía Almidón 12 g Fuente de N NO3 Na 0.5 g Base mineral PO4 HK2 1.0 g SO4 Mg 7 H2O Agente solidificante Agar 15 g Agua Agua destilada 1000 ml pH = 7

Preparación de medios de cultivo Pesar componentes sólidos: colocar recipiente para pesar tarar encender registrar la lectura colocar el componente a pesar

Disolver con agua destilada: hidratar componentes sólidos agregar agua disolver

Regular pH: pHmetro encendido y lavado lectura soluciones reguladoras protección del electrodo lavado del electrodo

Preparación de medio sólido agregar agar medio líquido fundir al calor medio agarizado

Fraccionar y acondicionar para esterilizar Fraccionamiento de medio líquido Fraccionamiento de medio sólido (en caliente) Acondicionado para esterilizar

Esterilizar en autoclave Medios en “Pico de flauta”

Portaobjeto enterrado Visualización de microorganismos: porta objeto enterrado Suelo en estudio Riego Portaobjeto enterrado Incubación

Cultivo de microorganismos del suelo en medio líquido Siembra Dilución Incubación

Preparación de muestras en laboratorio Tamaño del lote Muestreo de suelo Cantidad de muestras 0-20 cm. con rastrojos Profundidad Topografía Composición n° submuestras Guardar en conservadora Una muestra Preparación de muestras en laboratorio Oreado Tamizado Envasado y Rotulado Conservación en heladera

Esterilización en autoclave Laboratorio Práctico 2 Práctico 1 Esterilización Autoclave - horno Radiación Filtración Productos químicos Medio de cultivo Observación Aislamiento Composición química Base mineral Fuente de carbono Fuente de energía Agua Preparación de medios Líquidos Pesar drogas Disolver con agua destilada Regular pH Fraccionar Sólidos Pesar drogas Disolver con agua destilada Regular pH Agarizar Fundir Fraccionar Esterilización en autoclave Siembra de suelo Incubación

Actividades Preparación de muestras de suelo en laboratorio: tamizar, embolsar y rotular. Visualización de microorganismos de suelo: enterrar un portaobjeto. Cultivo de microorganismos de suelo: colocar una alícuota de suelo en medios general y selectivo enterrar un portaobjeto. Visita al Laboratorio de Microbiología Agrícola F.C.A