ESTUDIO BIOLOGICO DE TROMBOFILIA ¿CUANDO, COMO Y PORQUE? Dr. J.Fontcuberta Servei d’Hematologia Institut Universitari Dexeus Unitat d’Hemostàsia i Trombosi Hospital de la Santa Creu i Sant Pau Barcelona

TROMBOFILIA HEREDITARIA: Concepto Tendencia genéticamente determinada al tromboembolismo venoso. Debido tanto a anomalías dominantes como a combinaciones de defectos más leves. Clínicamente se caracteriza por: Edad temprana de inicio. Recidivas frecuentes. Historia familiar de trombosis. OMS e ISTH. 1996

INCIDENCIA ANUAL DE TROMBOEMBOLISMO VENOSO Heilt JA. Thromb Haemost 2001; 86: 452-463.

RECURRENCIAS Y FACTORES DE RIESGO DE TROMBOSIS Factores de riesgo transitorios mayores aislados (cirugía, inmovilización) riesgo recurrencia en 1er año: aprox. 3% Factores de riesgo transitorios (trauma, A.O., THS, viajes avión > 10h...) riesgo recurrencia en 1er año: aprox. 5% Factores de riesgo permanentes (cáncer, trombofilia, AAF. ) riesgo recurrencia en 1er año: aprox. 5 - 10 % Trombosis idiopáticas (con o sin factores de riesgo) riesgo recurrencia en 1er año: aprox.  10% C.Kearon, Circulation 2004 (supple I): I-10 - I-18

RIESGO ABSOLUTO DE RECURRENCIA TROMBOEMBOLICA (VTE) Y SANGRADO MAYOR Seguimiento Estudio Intensidad (INR) Riesgo Absoluto Recurrencia VTE Sangrado mayor Recurrencia VTE o Sangrado mayor

TROMBOFILIA ¿A quién debe de hacerse un estudio de trombofilia? ¿ Qué debe de contener un estudio de trombofilia? ¿Qué puede aportar al paciente y a sus familiares? ¿Cuándo debe de realizarse?

TROMBOFILIA ¿A quién? Pacientes con dos o más trombosis Trombosis venosas en menores de 50 años Antecedentes familiares de trombosis Trombosis idiopáticas? Trombosis de localización inusual?

TROMBOFILIA ¿Qué debe contener el estudio? La relación coste-beneficio debe de ser óptima en: Obtener el diagnóstico Ofrecer beneficio clínico

TROMBOFILIA ¿Qué debe contener el estudio? Los test diagnósticos de trombofilia deberían de cumplir los siguientes requisitos: Aportar información sobre etiología del evento Influir sobre la conducta terapéutica Influir sobre futuras situaciones de riesgo del pacientes y familiares

Causas biológicas de trombosis Población española Proteína C 3.19% Antitrombina 0.47% Proteína S 7.27% APCR 12.8% Desconocido 50% PT20210 17.2% Mateo et.al Throm Haemost 77:444.1997 Combinados 9% Mateo et.al Blood Coal Fibrinol 9:71.1998

TROMBOFILIA ¿Qué pruebas? Anomalías plenamente establecidas: Déficit antitrombina Déficit proteína C Déficit proteína S Resistencia proteína C activada Disfibrinogenemia Mutación FcV Leiden Mutación G20210A protrombina Anticuerpos antifosfolípidos (AL/aCL/ aB2GPI) Hiperhomocisteinemia

TROMBOFILIA ¿Qué pruebas? Otras anomalías relacionadas con trombofilia Elevación Fc. VIII ( Percentil 90), grupo sanguíneo ABO Elevación Fc. XI, IX, VII, TAFI Polimorfismos en Fc. V, VII, XII, XIII, Fg, PAI-1 Otros polimorfismos ...

TROMBOFILIA ¿Cuándo? Mínimo 3 meses después episodio de trombosis (sospecha déficit ATen fase aguda, si precisa AT) Sin influencia de trat. anticoagulante No embarazo ( 3 meses).

TROMBOFILIA ¿Porqué? Riesgo recidivas Duración y nivel anticoagulación? Detección de familiares portadores asintomáticos Profilaxis en situaciones de riesgo Tratamiento específico Minimizar exposición a situaciones de riesgo en familiares asintomáticos

SUPERVIVENCIA LIBRE DE TROMBOEMBOLISMO PROPOSITUS CON TROMBOFILIA VS FAMILIARES PORTADORES Vossen JTH 2004

RIESGO RELATIVO DE TROMBOEMBOLISMO FAMILIARES PORTADORES VS CONTROLES (Datos retrospectivos) Vossen JTH 2004

INCIDENCIAS DE TROMBOEMBOLISMO EN FAMILIARES PORTADORES ASINTOMÁTICOS (Estudios prospectivos)

ESTUDIO EPCOT Riesgo del primer evento de trombosis en portadores de algún defecto familiar de trombofilia C.Y.Vossen et al. J Thromb Haemost 2005; 3:459-64

ESTUDIO EPCOT Recurrencias después del primer evento de trombosis en familias con trombofilia Pacientes que NO reciben tratamiento anticoagulante durante el seguimiento

ESTUDIO EPCOT Recurrencias después del primer evento de trombosis en familias con trombofilia Pacientes que SI reciben tratamiento anticoagulante durante el seguimiento

ANTITROMBINA ¿Cómo? y ¿Porqué? Método: funcional (amidolítico). Ag sólo cuando funcional  Prevalencia: 0,5 % pacientes consecutivos con trombosis Inicio clínica: entre los 25-35 años el 50 % de los pacientes Recidivas sin TAO: global: 10,5% / año (3,8-22,8) varones: 11,6% / año (2,4-33,9) hembras: 9,5% / año (2,0-27,8) Recidivas con TAO: 2,7 (0,7-7,0) % / año Trombosis en asintomáticos sin TAO: 1,7% / año (controles: 0,1 (0,0-0,2) % / año) Recomendación: después del 1er evento  TAO indefinido J.Mateo T.H. 1997 C.Vossen ATVB. 2005

PROTEÍNA C ¿Cómo? y ¿Porqué? Método: funcional (amidolítico). Prevalencia: 3,2 % pacientes consecutivos con trombosis Inicio clínica: 40-50 años el 50 % de los pacientes Riesgo trombosis: 8-10 veces Recidivas sin TAO: global: 5,1% / año (2,5-9,4) varones: 10,8% / año (4,0-23,4) hembras: 3,1% / año (0,4-11,0) Recidivas con TAO: 0,6 (0,0-3,2) % / año Trombosis en asintomáticos sin TAO: 0,7% / año (0,3-1,6) Recomendación: no TAO después 1er evento. J.Mateo T.H. 1997 C.Vossen ATVB. 2005

PROTEÍNA S ¿Cómo? ¿Porqué? Método: proteína S L. Ag; opcional: prot. S total (Ag) prot S libre (func.) Prevalencia: 7,3% (tipo I y II); 3% (tipo I) Inicio clínica: 30-35 a. (tipo I); 50-55 a. (tipo III) el 50 % de pacientes Riesgo trombosis: 8-10 veces Recidivas sin TAO: global: 6,5 % / año (2,8-11,8); varones: 10,5% / año (3,9-22,9); hembras: 3,1% / año (0,4-11,0) Recidivas con TAO: 0,6 (0,0-3,2) % / año Trombosis asintomáticas sin TAO: 0,8 (0,3-1,9) % / año Recomendación: no TAO después 1er evento. J.Mateo T.H. 1997 C.Vossen ATVB. 2005

MUTACIÓN FcV LEIDEN ¿Cómo? ¿Porqué? Método: ensayos basados en DNA Prevalencia: heterocigotos: 13-20%; homocigotos: 2%. Inicio trombosis: 35-40 años, el 50 % de pacientes Riesgo trombosis: hetero. 5 veces; homo. 50 veces Recidivas sin TAO: global: 3,5 % / año (1,9-6,1); varones: 7,2% / año (2,9-14,9); hembras: 2,2% / año (0,8-4,8) Recidivas con TAO: 0,0 (0,0-8,5) % / año Trombosis asintomáticas sin TAO: 0,1 (0,0-0,6); controles 0,1 (0,0-0,2) % / año Recomendación: no TAO después 1er evento. Discutida profilax. antitrombótica J.Mateo T.H. 1997 C.Vossen ATVB. 2005

MUTACIÓN PROTROMBINA G20210A ¿Cómo? ¿Porqué? Método: ensayos basados en DNA Prevalencia: heterocigotos: 5-10% pacientes consecutivos Inicio clínica: 45-50 años, el 50 % pacientes Riesgo trombosis: 2,5 - 3 veces (heterocigotos) R.R. de recurrencias: 1,7 - 5 (heterocigotos) Recomendación: no TAO después 1er evento. Discutida profilax. antitrombótica

AC. LÚPICO / AC.ANTIFOSFILÍPIDOS Método: criterio subcomité ISTH Riesgo trombosis: 10 veces (ac.lupico+) 2 veces (ACA IgG) R.R. trombosis: 2 veces cuando se para TAO R.R. Recurrencias abortos: 5-15% Recomendaciones: 1er evento: TAO 12 m. INR 2-3 2º evento: TAO indef. INR 2-3; INR 2.5-3.5?

DÉFICITS COMBINADOS Estudio EPCOT Los más frecuentes: Prot.C+FcV Leiden, Prot.C+PT20210A, Prot.C+FcV Leiden+PT20210A R.R. de trombosis antes de entrar EPCOT: 46,7 (22,5-97,1) Inicio trombosis: 28 años, el 50% de pacientes y familiares Recidivas sin TAO: global: 5,0 (2,0-10,3) % / año varones: 10,7 (3,5-24,9) % /año hembras: 2,1 (0,3-7,7) % / año Recidivas con TAO: 0,9 (0,0-4,8) % / año Trombosis en asintomáticos sin TAO: 1,6 (0,5-3,7) % / año. Controles 0,1 % / año Recomendación: discutido TAO después 1er evento. J.Mateo T.H. 1997 C.Vossen ATVB. 2005

CONCLUSION (1) ¿A quién debe hacerse? A todo paciente que cumpla los criterios de trombofilia ISTH/OMS de 1996: Tromboembolismo espontáneo si ocurre en edad joven (< 50 años) o... Con historia familiar positiva de tromboembolismo o... Tromboembolismo de repetición o... Evento de localización atípica ¿En qué momento debe realizarse el estudio? Al menos 3 semanas después de finalizar el TAO

CONCLUSION (2) ¿Qué pruebas debe contener? El estudio debería contener al menos: Antitrombina funcional Proteína C funcional Proteína S libre (método antigénico) Mutación FV Leiden Mutación PT20210 G/A AAF (AL + ACA). Si resulta +, recomprobar al menos 1 vez Opcionalmente, se puede determinar: RPCA, por el método convencional Factor VIII. Si el resultado es > P90 de la distribución en la población se recomienda recomprobar al menos 1 vez. Homocisteína basal

CONCLUSION (3) ¿Porqué debe hacerse un estudio de trombofilia? En caso de: déficit de antitrombina, AAF recomprobados, déficit combinado o déficit de proteína C (con mucha clínica familiar) se indicará TAO indefinido. El riesgo de recidiva es mayor para: síndrome AAF, déficit de antitrombina y déficit combinado.

CONCLUSIONES (4) ¿Qué beneficios clínicos potenciales puede aportar dicha información a los familiares? Establecer profilaxis en las situaciones de riesgo según EPCOT las de mayor riesgo son gestación/puerperio y neoplasia asociada En mujeres, consejo sobre el uso de anticonceptivos orales y THS Realizar estudios de trombofilia, indirectamente puede mejorar el conocimiento de la enfermedad por parte de los familiares asintomáticos: Evitar situaciones de riesgo Solicitar profilaxis de forma adecuada Aumentar la velocidad del diagnóstico (y del tratamiento inicial) de nuevos eventos Modificar estilos de vida que disminuyan el riesgo de enfermedad cardiovascular.

Human Disease - + environment Mendelian Disease Complex Disease Gene Phenotype Phenotype Phenotype Phenotype + - environment

Rasgos complejos Hipertensión arterial Diabetes Cáncer Susceptibilidad a infecciones Obesidad Alcoholismo Enfermedad tromboembólica ........

Tipos de diseño Investigación de factores genéticos de una enfermedad compleja Asociación Muy utilizados Individuos no emparentados Cohortes de casos y controles Fácil reclutamiento Se limitan a genes ya conocidos Frecuentes falsos positivos No relación de causalidad Ligamiento “Inexistentes” en estudios de trombosis Individuos emparentados Grupos familiares Más difícil reclutamiento Capaces de detectar genes nuevos Más robustos estadísticamente Permiten establecer causalidad Gambaro et al, Lancet 2000;355:308-311

Fenotipos: Prot. C Prot. S F VIII, FvW, Hcy... Riesgo de trombosis

Objetive Identification of genes influencing quantitative variation of hemostatic-related phenotypes and susceptibility to thrombosis.

Design of GAIT project Ascertainment 12 families with thrombophilia.........214 individuals 9 control families...............................184 “ Total................398 “ Proband with idiopathic thrombophilia: all known biological causes of thrombosis were excluded. Extended pedigrees (> de 10 individuals in 3 or more generations).

Pedigrees 1

Pedigrees 2

Estructura de las familias GAIT relaciones de parentesco examinadas Relación Grado Nº parejas Individuos 0 398 Hermanos monocigotos 0 1 Padre - hijo 1 470 Hermanos 1 340 Abuelo - nieto 2 225 Tío - sobrino 2 693 Medio hermanos 2 13 Bisabuelo - bisnieto 3 13 Tío abuelo - nieto 3 137 Primos hermanos 3 547 Tío bisabuelo - bisnieto 4 9 Tío segundo - sobrino 4 233 Primos segundos 5 62

Phenotypes Individual clinical information Determination of hemostasis-related phenotypes: TTPA Antitrombin Tissue Factor Protromb. T Heparin Cofactor II D Dimer Fibrinogen Protein C amid. aCL..... IgG APCR Total Protein S IgM F. II Free Protein S aFS..... IgG F. V Functional Protein S IgM F. VII TFPI Homocistein F. VIII F.v Willebrand Reactive Protein C F. IX HRG 2 antiplasmin F. X Plasminogen 2-GPI F. XI PAI-1 Precalicrein F. XII t-PA HMWK F.XIII u-PA P-selectin

Análisis Genético: Estrategia Genes Candidatos (genes que codifican las proteínas implicadas en la hemostasia). Marcadores altamente polimórficos completamente ligados a estos genes. Polimorfismos intragénicos dialélicos asociados a trombosis. Exploración Global del Genoma (Genome-wide scan): 400 marcadores genéticos altamente polimórficos (mapa genético con una resolución de 10 cM).

Liability to thrombosis Souto JC et al. Am J Hum Genet 2000;67:1452-1459. 0.61  0.16 (p=0.00009) 21 extended families, 398 individuals Heit JA et al. J Thromb Haemost 2004;2:731-736. 0.52-0.62 751 families, 16,650 individuals

Heritabilities of Intermediate Phenotypes Phenotype h2 SE p aPCR 0.713 0.078 <0.0001 Factor XII 0.673 0.085 <0.0001 TM-mediated PT 0.560 0.080 <0.0001 sTfR 0.550 0.100 <0.0001 Factor VII 0.523 0.089 <0.0001 Factor XI 0.450 0.100 <0.0001 Factor VIII 0.400 0.088 <0.0001 Factor IX 0.390 0.090 <0.0001 Serum folate 0.320 0.091 <0.0001 vW factor 0.320 0.110 <0.0001 t-PA 0.268 0.072 <0.0001 Homocysteine 0.255 0.083 <0.0001 Souto et al. Circulation 2000;101:1546-51 Souto et al. Thromb Haemost 2002;87:68-73 Souto et al. Haematologica 2003;88:1436-8

Genome-wide Scan ~ 363 marcadores 9.5 cM = 9.500 Kb ~9.5 cM Quantitative Linkage Analysis Phenotypes: Prot. C Prot. S F VIII, FvW, Hcy... Thrombosis risk

Genome-wide Scan of Factor XII h2 = 67% QTL no candidate gene Factor XII structural gene Soria JM et al. Am J Hum Genet 2002;70:567

Allele frequencies in the GAIT sample FXII 46C/T Blood 1998;91:2010-4 Allele frequencies in the GAIT sample C 0.79 T 0.21

FXII – Chromosome 5 QTL with 46C/T SNP Soria JM et al. Am J Hum Genet 2002;70:567

GAIT Sample: FXII Levels by FXII 46C/T Genotype CC 129 % CT 92 % TT 55 % p < 110 -7

FXII – Chromosome 5 QTL with 46C/T SNP

FXII – Chromosome 5 QTL with 46C/T SNP

Estudio de Asociación: FXII 46 C->T 250 Pacientes con trombosis venosa 250 Controles no emparentados CC=126 CT=93 TT=62 (p<0,0001) OR= 4,9 (IC95%: 1,5-15,8). Ajustada por sexo, edad, FVL, PT20210, niveles de FVIII y presencia de AcAF.

Infarto de Miocardio: FXII 46 C->T 174 Pacientes con Infarto de Miocardio 211 Controles no emparentados CC=124 CT=98 TT=52 (p<0,0001) OR= 4.8 (95% CI: 1.2-20.5). Ajustada Santamaria et al. Haematologica 2004 (en prensa)

Accidente cerebrovascular: FXII 46 C->T 205 Pacientes con Accidente cerebrovascular isquémico. 231 Controles no emparentados CC=127 CT=95 TT=58 (p<0,0001) OR= 4.1 (95% CI 1.1-15.9). Ajustada Santamaria et al. Stroke 2004; 35:1795-9

Sumario: 46 C->T en el gen F12 Efecto Funcional: Genera una nueva Met que disminuye la eficiencia en la traslación del gen del FXII (Kanaji et al., 1998). Análisis de ligamiento genético: Lod score de 10.21 entre este SNP y los niveles de FXII. Lod score aumenta a 11.7 (p=0,004) con el riesgo de trombosis. Estudio de Asociación: O.R. De 4-5 con TVP, IM y AVC. Existen suficientes evidencias para considerar al polimorfismo 46 C->T en el gen del F12 como un nuevo factor de riesgo tromboembólico.

QTL Localization: Fibrinogen genome scan Fibrinogen genes ?? TCF 1 Soria JM et al. 2004 (submitted)

Conclusiones: Este es el primer proyecto diseñado para abordar la complejidad de la enfermedad tromboembólica, usando familias extensas y sofisticados métodos de Estadística Genética. Los resultados demuestran que los fenotipos de la hemostasia tienen una alta heredabilidad y que varios QTLs influyen la susceptibilidad (riesgo) a padecer enfermedad tromboembólica. Fine mapping, estudios basados en la identificación de genes y una exhaustiva enumeración de los polimorfismos funcionales en los genes identificados son imprescindibles para documentar los factores genéticos que determinan el riesgo de trombosis en nuestra población.

GAIT Project Unitat d’Hemostàsia i Trombosi Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona (Spain) Medical Staff José Mateo Isabel Montserrat Amparo Santamaría Joan Carles Souto Nuria Pujol Jordi Fontcuberta Plasma Laboratory Merce Garí Rosa Felices Dolors Llobet Rosa Ortín Teresa Urrutia Ruth Forner Montserrat Borrell Genetic Laboratory Immaculada Coll Elisabeth Martinez-Sánchez Isabel Tirado Cristina Vallvé Elisabeth Martinez-Marchán María Sabater Lleal Carolina Mordillo José Manuel Soria Datamanager Ramón Souto Alfonso Buil Administrative Staff Beatriz Carreras MªJesús Gallego Southwest Foundation for Biomedical Research. Population Genetics Department. San Antonio, Texas (USA). John Blangero Laura Almasy William Stone

GAIT’s Collaborations Centre National du Genotypage, Evry, Paris (France). Mark Lathrop Delphine Bacq Alexandra Faure Department of Pathology and Laboratory Medicine Emory University School of Medicine. Atlanta (USA) Tom E. Howard Deepa Machiah Kodandera Kevin R. Viel Departament de Biologia Evolutiva. Universitat Pompeu Fabra. Barcelona (Spain). Jaume Bertranpetit Francesc Calafell Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC). Departamento de Inmunología. Madrid (Spain). Santiago Rodriguez de Cordoba Jorge Esparza-Gordillo Departament de Bioquimica. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona (Spain). Francisco Blanco Vaca Jesús Martínl