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Publicada porAdelita Alo Modificado hace 10 años
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ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
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OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA
Escherichia coli Medio LB + KANAMICINA
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Se “introducirá el vector pET-TEM
Sitio múltiple de restricción Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa Origen de replicación
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PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled circular covalently closed Oc: open circular
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La diferencia en TAMAÑO entre el DNA cromosomal y el DNA plasmídico permite desarrrollar estrategias de purificación Plásmidos
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TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
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TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
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TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
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PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled circular covalently closed Oc: open circular
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Purificación de plásmidos
Química Mecánica Cambios en la Tempratura 1. Lisis 2. Remover partículas grandes Centrifugación Filtración (uso de membranas) 3. Purificación intermedia Precipitación fraccionada Adsorción a membranas Métodos cromatográficos: Intercambio iónico Filtración en gel Afinidad 4. Purificación alta resolución Disolver Liofilizar Formular 5. Conservar
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ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE
PLÁSMIDOS POR LA TÉCNICA DE LISIS ALCALINA
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Aislamiento de plásmidos por el método de lisis alcalina
Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria
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Solución GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9
La glucosa no tiene carga pero es un osmolito El EDTA une cationes divalentes como Mg2+ y Ca2+ en la membrana celular, debilitando la membrana. También el Mg2+ es cofactor de Dnasas
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Componentes de la solución GTE
Glucosa Tris-HCl
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Solución de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1%
Esta solución disuelve los fosfolípidos y los componentes proteícos de las membranas celulares. SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CÉLULAS El NaOH desnaturaliza el DNA plasmídico y cromosomal
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Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con proteínas y lípidos.
El DNA cromosomal que se renaturaliza se “atrapa” en el precipitado SDS/proteínas/lípidos. Sólo el DNA plasmídico y moléculas de RNA “escapan” del precipitado y SE ENCUENTRAN EN EL SOBRENADANTE
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El isopropanol precipita los ácidos nucleícos
Incubar por 20 min a -20°C El isopropanol precipita los ácidos nucleícos Lavar el “botón” con etanol al 70%: remueve sales y remanentes de SDS. También remueve el isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se evapora más rápido
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Purificación de plásmidos
Por ejemplo unión al pétido 16mer NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-Gln-COOH
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Electroforesis en geles de agarosa
¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos? Absorbancia 260 nm Electroforesis en geles de agarosa
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Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos
1 Precipitación con isopropanol 2 Cromatografía intercambío aniónico 3 Filtración con membrana de nitrocelulosa 4 Lo que se retuvo en la membrana de nitrocelulosa DNA cromosomal Plásmido abierto Plásmido superenrrollado
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Microscopia de polímero de agarosa
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Uso de “colorantes”
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Tinción con Syber Safe
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