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Tema 14. Taxonomía molecular.

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1 Tema 14. Taxonomía molecular

2 Filogenia molecular basada en marcadores moleculares: el ADNr procariota, 16S, 23S; el ADNr eucariótico: 18S, 28S y 5,8. Métodos de fingerprinting: ITS, RAPD, ARDRA, BOX, REP, ERIC, ribotyping, ADN mitocondrial. Métodos de estudios basados en el ADN de comunidades microbianas: FISH, DGGE, T-RFLP. Bioinformática. Concepto e Importancia. Bases de datos en Internet: NCBI, EMBL. Software (DNAman, MEGA 4, Treeview) y Programas on line para análisis de secuencias: Workbench Biology, Eztaxon Server, Ribosome DataBase Project, NCBI. Algoritmos de comparación: BLAST. Construcción de Árboles Filogenéticos.

3 La taxonomía estudia los principios de clasificación de los organismos según las semejanzas y diferencias de sus caracteres. La sistemática trata de los resultados que se obtienen al aplicar tales principios

4 Las unidades sistemáticas de cualquier categoría se designan con el nombre de taxones o estirpes
Las especies que poseen una serie de caracteres comunes se agrupan en Géneros, éstos de forma análoga en Familias; Órdenes, Clases Divisiones.

5 Dentro de las especies suelen distinguirse Subespecies, Variedades, Líneas y Clones o Cepas.
Población de células genéticamente idénticas, procedentes de una sola

6 Tradicionalmente hemos visto la biodiversidad relativa a nuestra escala de conocimiento. Nuestra especie es una dentro de que ahora existe y muchos que existieron en el pasado. Estas especies se han desarrollado durante un periodo de años. Durante la mayor parte de este tiempo las formas han existido las formas microbianas.

7 De los 3 dominios de la vida, 2 son exclusivamente procariotas, pero ellos contienen solamente alrededor de 5000 especies conocidas. Muchas mas especies microbianas son conocidas entre los eucariotas, pero aun muchas menos que el número de especies animales

8 Mucha de la biodiversidad no es vista por nosotros y fue totalmente desconocida hasta antes de la invención del microscopio por Van Leeuwenhoek en el siglo XVII. De acuerdo con la tradición, todas las cosas vivas fueron ubicadas en reinos animal y reino vegetal. Cuando los microbios aparecieron, fueron puestas dentro de este sistema; bacterias, hongos y algas como las plantas y protozoos como animales. Llegaron cambios necesarios para acomodar las diferencias fundamentales tales como las células eucariotas y procariotas.

9 Los Macro-organismos se desarrollaron a partir de los microbios y fueron capaces de extender la vida regiones desérticas de la tierra, creando los nuevos hábitat para los microbios en el proceso. Esto fue relativamente reciente en la evolución.

10 Relativamente poco de la diversidad microbiana existente es conocido por el hombre.
Esto significa que hay un potencial enorme para encontrar los nuevos recursos para la biotecnología.

11 Echemos una ojeada breve algunos de los grupos microbianos que se conocen en la actualidad
La diversidad de los organismos vivos es tan grande que no hay definición simple de especie aplicable a todos los grupos. Esto hace que sea imposible hacer una comparación significativa de diversidad entre diferentes grupos.

12 Definición taxonómica de las especies
En microbiología - especialmente en bacterias y levaduras: grupos genéticamente aislados de organismos altamente similares (los criterios son descendiente fértil del acoplamiento, como en la especie biológica, o la semejanza del genoma en más del 70% basada en hibridaciones cuantitativas in vitro de ADNn/ADNn, o la alta semejanza en base a secuencias de ciertas regiones homólogas del ADN).

13 La especie biológica - sobre todo desarrollada por los zoologistas: Dobzhansky 1937: " las especies son sistemas de poblaciones: el intercambio de genes entre estos sistemas esta limitado o prevenido por un mecanismo de aislamiento reproductivo o quizás por una combinación variada de dichos mecanismos."

14 Las especies filogenéticas - un grupo monofilogenético integrado por el conjunto diagnosticable más pequeño de organismos individuales dentro de los cuales hay un patrón parental de la ascendencia y de descendencia. (Cracraft, 1983).

15 Estimaciones del número de especie descripta y de especie posible de microorganismos no descriptas. (World Conservation Monitoring Center, 1992, Global Biodiversity, D. L. Hawksworth and R. R. Colwell)

16 Grupo Especies Descriptas Especies estimadas %Con.
Algas Bacterias ,1 (incluye no cultivables) Hongos ,0 Protozoarios Virus (incluye plásmidos, fagos etc.) Total

17 La verdadera dimensión de la diversidad microbiana fue reconocida recién en las pasadas décadas con el desarrollo de métodos genéticos molecular.

18 Cronómetros evolutivos
Macromoléculas celulares que ayudan a medir cambios evolutivos: • De Distribución universal • Funcionalidad homólogo • Alineación apropiada de las secuencias • Índice de cambios lento Secuencias de: • Citocromos • Ferredoxinas • Otras proteínas (ATPasas, RecA) • ARNs

19 El ARN Ribosomal como cronómetro evolutivo
• Moléculas antiguas • Funcionalmente constante • Distribuido universalmente • Moderado secuencias conservadas • Gran número de secuencias disponibles

20 Huella dactilar molecular
ARDRA RFLP by PFGE RAPD ITS t-DNA Secuenciado de ARNr Perfil Plasmídico SSCP Huella dactilar para comunidad FISH DGGE T-RFLP Real time-PCR

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23 rRNA operon of Prokaryotes
5S rRNA (120 nucleótidos) 16S rRNA (1500 nucleótidos) 23S rRNA (2900 nucleótidos)

24 Operon ARNr

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27 Operon ARNr de Eucariotas
5.8S ARNr 18S ARNr 28S ARNr

28 Árbol filogenético Distancia: distancia evolutiva, basada en las diferencias Parsimonia (Parsimony): mínimos cambios en la líneas de un ancestro común

29 Filogenia tentativa de los eucariotas basado en la secuencia ribosomal y comparaciones (Perry & Staley 1997)

30 Librerías de Colección
Biodiversidad Métodos Convencionales Métodos Moleculares Extracción de ADN total Screening, enriquecimiento aislamiento Evolución Directa Librerías de Colección Identificación y caracterización Cultivos puros Screening, enriquecimiento aislamiento Expresión de la/las enzimas de interés Evaluación de los procesos Librerías metabólicas Optimización de producción Transferencia

31 Secuencia de ADNr de un cultivo de microorganismo puro
BACTERIA 5’ 3’ ADN AISLADO 5’ 5’ 3’ Cebadores universales para PCR Gel de agarosa Tamaño correcto Banda simple Secuenciado Análisis de la secuencia

32 Cultivos no individiuales
Comunidades microbianas ADN AISLADO Microorganismo aislado 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ Clonado Cebadores específicos para PCR Secuenciado Análisis de las secuencias T-RFLP DGGE FISH Real-time PCR

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34 Pulsed field gel electrophoresis PFGE
ADN cromosomal obtenido por PFGE de cepas de Z. mobilis digeridas con NotI (a) y SfiI (b). Lanes: M, Mid. Range I Molecular Weight PFGE Marker; 1, PROIMI A1; 2, ATCC 10988T; 3, ATCC 29191; 4, ATCC 29192T.Migration conditions: 3 V cm-1, 9 s, 40 h.

35 RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA
RAPD analysis of Z. mobilis strains. Lanes: M1, Molecular Weight Marker 100 bp DNA Ladder; M2, 1 kb DNA Step Ladder; 1, PROIMI A1; 2, ATCC 10988T; 3, ATCC 29191; 4, ATCC 29192T. Primers used: (a) UBC4; (b) B6; (c) B7; (d) B9; (e) A8.

36 SSCP Single-Strand Conformation Polymorphism
SSCP is the electrophoretic separation of single-stranded nucleic acids based on subtle differences in sequence (often a single base pair) which results in a different secondary structure and a measurable difference in mobility through a gel.

37 El proceso usado durante el desarrollo de SSCP fue el siguiente:
Digestión del ADN total con enzimas de rectricción Desnaturalización en solución alcalina Electroforesis sobre gel de poliacrilamida neutro Transferencia a una membrana de nylon Hibridización con otro fragmento de ADN o mas claro empleando copias de ARN sintetizadas sobre cada cadena usadas como sondas (Orita et al., 1989).

38 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

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40 Aplicaciones de la técnica de DGGE.

41 Estudiar diversidad de microorganismos ambientales en una comunidad compleja (16S rDNA) o diversidad de genes catabólicos. Estudiar las poblaciones con actividad metabólica o genes activos por análisis de productos de RT-PCR Estudiar la distribución espacial y temporal de poblaciones bacterianas: Monitoreo en el tiempo Analizar como varía la composición de las poblaciones frente a cambios ambientales (contaminación, clima, perturbación)

42 Buscar microorganismos “indicadores” y específicos
Monitorear la liberación de microorganismos genéticamente modificados Screening de mutaciones en genes específicos: diagnóstico de enfermedades

43 Ventajas - La secuenciación individual de bandas puede revelar información filogenética → se evita la clonación y la selección previa secuenciación - Análisis de hibridación de los perfiles con sondas específicas de grupo (Agrobacterium tumefasciens) - Se pueden correr simultáneamente fragmentos patrones correspondientes a grupos o especies específicas → identificación directa - El bandeo complejo puede reducirse usando primers específicos de grupo (cyanobacterias, agrobacteria, actinomycetes)

44 Ventajas • Amplificar fragmentos de genes funcionales presentes en grupos particulares de bacterias ([NiFe] hidrogenasas en Desulfovibrio) • Análisis simultáneo de gran cantidad de muestras en poco tiempo (2 geles simultáneos con 30 calles c/u en 3 hs) • Se pueden identificar las bandas si se corren simultáneamente patrones específicos

45 Desventajas: • No se pueden correr más de 500 pb • Existen diferencias gel a gel, pero las posiciones relativas de las bandas permanecen estables • Hasta que una banda en el gel es verificada, la sola posición en el gradiente no tiene significado • No es posible separar fragmentos de DNA con cierta “cantidad” de variación de secuencia

46 Desventajas: • Se pueden observar “bandas dobles” como resultado de la presencia de “bases balanceantes” en primers degenerados solamente muestra los fragmentos de DNA de las especies predominantes de la comunidad (se estima que las bacterias que estén en proporción superior al 1%) • La microheterogeneidad de secuencias y la presencia de múltiples operones pueden llevar a una sobrestimación del nº de bacterias de una comunidad.

47 Limitaciones de la técnica
1. Manipuleo en la toma de la muestra: condiciones de muestreo y mantenimiento de la muestra 2. Extracción de ácidos nucleicos: lisis reproducible de todas las bacterias, remoción de sustancias que inhiben la reacción de PCR (ács. húmicos, exopolisacáridos) 3. Reacción de PCR: - Amplificación diferencial o preferencial (por renaturalización del templado) - Formación de heterodúplex (renaturalización de productos de PCR)

48 Conclusiones ♦ DGGE ofrece una rápida detección de las poblaciones predominantes AMPLIFICABLES. ♦ Detecta rápidamente diferencias en las secuencias de fragmentos de genes homólogos amplificados por PCR.

49 Diferentes etapas para el análisis de comunidades microbianas con el DGGE

50 Terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP or sometimes T-RFLP) is a molecular biology technique for profiling of microbial communities based on the position of a restriction site closest to a labeled end of an amplified gene. The method is based on digesting a mixture of PCR amplified variants of a single gene using one or more restriction enzymes and detecting the size of each of the individual resulting terminal fragments using a DNA sequencer

51 Por que nos enfocamos en el ARNr
RNA content/cell: • ~ 80% del ARN celular es ARNr • ~ 15% del ARN celular es ARNt • ~ 5% del ARN celular es ARNm

52 Aspecto microbiano de la biodiversidad
• Es imposible de cuantificar la abundancia de un organismo no cultivable La posibilidad para realizar “genómica ambiental” abre una perspectiva para determinar el potencial fisiológico de microorganismos no cultivables

53 Precauciones Saber que la heterogeneidad del gen ARNr debe ser por arriba del 5-6% de la secuencia disimilar (Haloarcula, Thermobispora) El estudio apropiado debe contribuir con un buena calidad de secuencia de ARNr (p.e. evitando artefacto de PCR) debe ser conducido por una muestra bien documentada desde los sitios característicos, preferentemente acompañado por cultivos y experimentos de hibridización

54 Por que buscar la diversidad microbiana
Estrategias y limites de vida El rol de los microorganismos en los ciclos biogeoquímicos Una fuente de biotecnología Para el monitoreo de cambios medioambientales Para la protección de los organismos superiores Para el entendimiento de la ecología y los principios de evolución

55 Cómo determinar diversidad microbiana
Análisis de secuencias randomizadas inserto en los clones Hibridización con sondas taxón específicas • RFLP • ARDRA • DGGE • TGGE • T-RFLP

56 Terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)
Técnicas de cultivos independientes para el seguimiento de comunidades microbianas Basado en amplificació por PCR de marcadores genéticos de ARNr 16s Aspectos a considerar: 1) limites de detección, 2) reproducibilidad, 3) cuestiones biológica para tratar diversidad total Miembros predominantes Dinámica de la población, etc

57 Cebadores marcados fluorescentemente
Pares de cebadores universales: FAM63F and HEX1389R (numerados por E. coli) De acuerdo al sistema de seguimiento, el mas usado para estudios ecológicos Regiones mas amplificadas del gene ARN16s

58 Protocolo para T-RFLP 1. Extracción del ADN de la comunidad o muestras de ARN medioambientales 2. Amplificación por PCR del gen ARNr 16s con cebadores fluorescentes 3. Digestión con enzimas de restricción (ej. CfoI, AluI) 4. Detección y determinación del tamaño de los fragmentos terminales marcados por electroforesis capilar o en gel CfoI profile

59 Perfil del T-RFLP : Electroferograma
•Diferentes fragmentos provienen de diferentes organismos • Diversos organismos pueden compartir un tamaño común de fragmento terminal La Altura de pico “en principio” correlacionado a la abundancia del grupo de organismos (?)

60 Los Pro y contra de T-RFLP
LIMITACIONES •Predispocisión inherente a los fundamentos técnicos de PCR Datos generados dependientes de la elección de enzima de restricción Un grupo grande de organismos puede compartir el mismo tamaño terminal del fragmento El tamaño evidente puede diferenciar de tamaño real y varía con el tipo de análisis genéticos VENTAJAS • Técnica directa • Alta reproducibilidad en cada paso del proceso • altamente Preciso (si no siempre exacto) • Los datos pueden ser objetivamente procesados digitalmente


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