FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)

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1 FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)

2 La fluorescencia in situ detecta secuencia de ácido nucleico por una sonda fluorescente que hibridiza específicamente a su secuencia complementaria dentro de la célula intacta

3 Aplicaciones 1 Identificación/cuantificación de organismo cultivables/no cultivables de muestras medio ambientales, dentro de organismo como endosimbiontes, o enriquecimientos. 2 Monitoreo de la dinámica poblacional en medio ambientes y/o enriquecimientos. 3 Visualización de la relación entre comunidades microbianas como biofilms, sludge (lodos), etc. 4 Identificación morfológica o relaciones en tipos de comunidades de microorganismos.

4 Limitaciones 1. Cantidades decrecientes de ARNr blanco
= baja o señal nula debido a células quiescentes o metabólicamente inactivas 2. Autofluorescencia de fondo, incluye cianobacteria, tejidos vegetales, etc. 3. La permeabilidad de los tejidos o la dificultad de la sonda para atravesar la células como Gram+, Archaea, etc.

5 Pasos principales Fijación de la muestra Inmobilización sobre portas Hibridización con los oligos marcados fluorescentes Lavado del porta (mejora la astringencia) Conteo de la cepa con tinta no específica (como DAPI o 4',6-diamidino-2-phenylindole is a fluorescent stain that binds strongly to DNA ) Agregado del montante anti-blanqueo Observación bajo el microscopio de epifluorescencia

6 Características del ARNr
Cadena simple Moléculas antiguas Funciones constantes Distribuido universalmente Filogenéticamente bien conservada

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8 DAPI o 4',6-diamidino-2-phenylindole is a fluorescent stain that binds strongly to DNA emission maximum is at 461 nm blue/cyan DAPI will also bind to RNA, though it is not as strongly fluorescent. Its emission shifts to around 500 nm when bound to RNA

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10 Specific Detection of Arcobacter and Campylobacter Strains in Water and Sewage by PCR and Fluorescent In Situ Hybridization Yolanda Moreno,1 Salut Botella,1 Jose´ Luis Alonso,2 María A. Ferru´s,1 Manuel Herna´ndez,1 and Javier Herna´ndez1

11 Sonda de isótopos estables
Que se está haciendo?

12 PCR en tiempo real En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial. Además, mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.

13 Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos: •agentes intercalantes: SYBR Green •sondas específicas marcadas con fluorocromos diseñados de manera especial.

14 Real Time PCR PCR en tiempo real PCR cuantitativa PCR cinética
Medición de la formación de un producto de PCR en tiempo real Requiere Fluorocrómo Sistema óptico de detección Para la cuantificación, se mide en cada ciclo de PCR la cantidad de amplicón producido. La cuantificación del producto se produce mediante la adición de fluoróforos que se unen al amplicón de forma cuantitativa, de forma que a mayor producto mayor fluorescencia se emitirá. Los sistemas de PCR a tiempo real detectan la cantidad de fluorescencia producida en cada ciclo de PCR y los softwares de análisis representan dicha fluorescencia gráficamente respecto al número de ciclos. La cantidad de amplicón producido es proporcional al número de moléculas de RNA/DNA iniciales, de forma que en aquellas muestras con mayor expresión del gen el amplicón fluorescente aparecerá en ciclos anteriores Tipos de fluorocromos Se utilizan principalmente dos tipos de fluorocromos. Un método muy utilizado por su menor coste es el emplear fluoróforos que se unen a DNA de doble cadena, como SYBR Green. El SYBR Green se une inespecíficamente al DNA de doble cadena y produce fluorescencia. Estos fluorocromos no son específicos ya que se unen a toda molécula de DNA de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer. Otra alternativa, más cara pero recomendada cuando hay problemas de especificidad, es el uso de sondas específicas fluorescentes, como las sondas TaqMan. Esta técnica permite la cuantificacación específica del cDNA de interés incluso en la presencia de amplificación inespecífica (dímeros de primer, DNAg). El uso de SYBR Green implica un diseño muy cuidadoso de los primers con el fin de evitar dímeros de primer, y evitar la amplificación de DNA genómico contaminante en la muestra de cDNA, para ello, deben diseñarse los primers de forma que el amplicón contenga secuencias de diferentes exones. 14

15 Emisión de Fluorescencia
Real Time PCR SYBR® Green Sondas Fluorocromo Silenciador Separación Emisión de Fluorescencia

16 Real Time PCR Ciclo umbral:
Nº de ciclos necesarios para detectar fluorescencia Inversamente proporcional a [Molde] inicial Fluorescencia Existen además gran variedad de formatos de detección (figura 1). La señal fluorescente es proporcional a la cantidad de producto de la PCR y la generan los fluoróforos específicos de DNA bicatenario o las sondas fluorescente específicas de la secuencia. El SYBR-Green I (figura 1a) es el fluoróforo específico de DNA bicatenario más usado en la RT-PCR. Este fluoróforo se une con gran afinidad al surco menor del DNA bicatenario, aumentando su fluorescencia unas 1000 veces. La detección con SYBR-Green I es tan sensible que llega a identificar la producción de una única molécula. Este formato de detección necesita una puesta a punto previa para que la PCR no amplifique productos inespecíficos que luego el fluoróforo detectaría, introduciendo errores en el posterior análisis de los resultados. Para detectar específicamente una secuencia se utilizan sondas de oligonucleotidos etiquetadas con fluoróforos. La intensidad de la señal se relaciona con la cantidad de producto de PCR de dos formas: a) una disminución del amortiguamiento de la fluorescencia dependiente de producto, en la que el fluoróforo (la molécula delatora) y el amortiguador (quencher) se separan al unirse la sonda a la diana (figura 1c, d, e, f); b) un incremento de la transferencia de energía resonante fluorescente (FRET) del donador al fluoróforo aceptor al quedar cercanos cuando se une la sonda a la diana (figura 1b). El SYBR-Green I produce resultados muy precisos en la cuantificación del producto. Por otra parte, las sondas específicas de secuencia facilitan la identificación de mutaciones y permiten realizar múltiples experimentos simultáneamente al poder utilizar varias sondas con fluoróforos distintos a la vez Nº de ciclos [ADN molde]i 16

17 Agentes intercalantes
Ventajas: optimización de las condiciones de la reacción fácil y es más barato que las sondas específicas. Inconveniente Baja especificidad: emplear condiciones de reacción óptimas Selección cuidadosa de los cebadores para disminuir el riesgo de formación de dímeros es recomendable iniciar la síntesis de ADN a temperaturas elevadas ( h o t-start PCR): polimerasas recombinantes modificadas que sólo funcionan

18 Cada fragmento amplificado tiene una Tm característica, que depende sobre todo de su longitud y de la composición de sus bases. Esta aplicación permite comprobar, aunque no siempre con absoluta garantía, la especificidad de los fragmentos detectados en la PCR.

19 Sondas de hibridación específica
Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas. Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan, las s o n d a s molecular beacons y las sondas FRET.

20 Cascade blue (varios) Y O Y O- B o d i p y f fluoresceína (FITC) SYBR Green T O T O- F A M L u c i f e r i n a T E T J O E H E X C y 3 P O P O- R o d a m i n a N E D T A M R A Naranja de acridina C y 5 Quantum Red/Red Bromuro de etidio R O X Red Rojo de Tejas Homodímero de etidio Yoduro de propidio 7 IRD C y 7 IRD 800

21 Sondas de hidrólisis Son oligonucleótidos marcados con un fluorocromo donador en el extremo 5’ que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3’ que absorbe la fluorescencia liberada por el donador. Para que esto ocurra, las moléculas donadora y aceptora deben estar espacialmente próximas. Además, el espectro de emisión de la primera se ha de solapar con el espectro de absorción de la segunda.

22 Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor. Sin embargo, durante la amplificación, la sonda se hibrida con su cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la cadena, la ADN polimerasa hidroliza el extremo libre 5’ de la sonda, produciéndose la liberación del fluorocromo donador. Como donador y aceptor están, ahora, espacialmente alejados, la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector.

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24 Indicadores moleculares
Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una molécula donadora en el extremo 5’ y una aceptora en el extremo 3’, además, presentan una estructura secundaria en forma de loop, en la que reside la secuencia de unión específica con el ADN diana. Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no está hibridada, lo que conlleva que donador y aceptor estén muy cerca uno de otro. En esta conformación la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo. Sin embargo, al hibridar con el ADN diana la sonda se abre, alejándose donador y aceptor, pudiendo ser detectada la fluorescencia emitida por el primero.

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26 Identificación polifásica de microorganismos
Técnicas de MALDI-TOF MS LC MS/MS

27 La tecnología MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry) incorporada recientemente en el laboratorio de microbiología ha demostrando ser un método rápido y preciso para la identificación bacteriana.  MALDI-TOF identificó adecuadamente a 95,7% de los aislados aeróbi-cos y 86,4% de los anaeróbicos estrictos, observándose el mayor porcentajes de identificación a nivel de especie en los grupos de enterobacterias yBacteroides spp (95 y 100% respectivamente). La tasa de error de MALDI-TOF y métodos convencionales vs secuenciación fue de 0,39 y 9,4%, respectivamente. El costo asociado por identificación fue ocho veces menor que el de los métodos tradicionales con una demora promedio de seis horas en la entrega de resultados.Conclusión: MALDI-TOF mostró ser una tecnología simple, precisa y de menor costo que los métodos tradicionales.

28 Permite la identificación de microorganismos mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosomales, a partir de colonias o directamente de muestras a través de la creación de un espectro de masas el que es específico para cada especie

29 Diseño de oligonucléotidos
En el TP Nº1 (PCR) se encuentran las consideraciones más importantes a tener en cuenta para el diseño de primers. Aprenderemos a cómo diseñar los oligonucleótidos Detectar el gen de la enzima Superóxido Dismutasa de Niquel (SodN) en la cepa Streptomyces sp. BM

30 Búsqueda en base de datos de secuencias de la SodN.
En la pestaña All databases seleccionar Nucleotide (se conoce la secuencia del gen SodN) En la pestaña Search escribir Ni-containing superoxide dismutase. Presionar Search

31 Seleccionar la 4º opción de la lista (para este caso es apropiado, porque sabemos que corresponde a la enzima que estamos buscando).

32 Buscar en la página SodN

33 Seleccionar gene

34 Copiar la secuencia resaltada y pegarla en un archivo de texto.
>SodN Atgctttcccgcctgtttgcccccaaggtcacggtcagcgcccactgcgacctgccctgcggcgtgtacgaccctgcccaggcccgcatcgaggcggagtcggtgaaggccgtccaggagaagatggccggcaacgacgacccgcacttccagacgcgcgccacggtcatcaaggagcagcgcgccgagctcgcgaagcaccacgtctccgtgctgtggagcgactacttcaagcccccgcacttcgagaagtacccggagctgcaccagctggtcaacgacaccctgaaggccctgtcggccgccaagggctcgaaggacccggcgaccggccagaaggccctggactacatcgcccagatcgacaagatcttctgggagaccaagaaggcctga

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36 Seleccionar BLAST y pegar la secuencia. Correr el BLAST

37 Seleccionar y copiar las secuencias de ADN de
: Streptomyces avermitilis MA-4680 Streptomyces acidiscabies strain E13 Streptomyces flavogriseus ATCC 33331 Streptomyces peucetius ATCC 27952

38 -Analizar el alineamiento
-Abrir el programa DNAMAN y cargar todas las secuencias Realizar el alineamiento de las 5 secuencias. -Seleccionar el ícono alineamiento y luego presionar Channel y seleccionar las 5 secuencias. -Analizar el alineamiento

39 -Copiar la secuencia consenso y pegarla en el canal 6 -Ir a Primer/Design PCR Primers for DNA y seguir los pasos indicados en las pantallas siguientes

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42 Seleccionar el par de primer más adecuado.
Evaluar las características de los pares de primers generados por el programa. Copiar la secuencia del primer cebador, ir a Primer/Load primer/ From input y pegar la secuencia. Ir a Primer/Self complementary. Analizar. Ir a Primer/Two primer complentarity/Second primer from input y pegar el segundo primer. Analizar. Para este primer repetir el punto b Repetir para todos los pares de primers obtenidos. Seleccionar el par de primer más adecuado.

43 PCR in silico. Para ello, debes ingresar en http://insilico. ehu
PCR in silico. Para ello, debes ingresar en De la lista de genomas que se te despliega debes elegir “Bacillus” y luego ingresas a una página donde debes pegar la secuencia de los primers que diseñaste anteriormente.

44 Oprimir aplified

45 Bases de datos en Bioinformática

46 Introducción a la Bioinformática
Contenidos La bioinformática y las bases de datos Las bases de datos en biología molecular Formato de la información almacenada Introducción a la Bioinformática 46

47 Información en la era genómica
El proyecto genoma humano y similares genera un inmenso flujo de información Para poder utilizar esta información, ha de estar almacenada correctamente El acceso a la información almacenada ... Ha de ser rápido Debe poder hacerse de manera flexible Esto es posible gracias a la creación de bases de datos y distribución vía Internet. Introducción a la Bioinformática 47

48 Para que se utilizan las bases de datos ?
Búsqueda de información. Por palabra clave, números de acceso, autores... Búsqueda de homologías ¿Hay secuencias igual o parecidas a la mía ? Búsqueda de patrones ¿Mi secuencia contienen patrones conocidos? Predicciones ¿Puedo encontrar proteínas parecidas a la mía, pero con función conocida? Introducción a la Bioinformática 48

49 Aspectos a tener en cuenta
Los proveedores de recursos Centros o organizaciones especializadas en tener y mantener las bases de datos. Bases de datos Hay mucha variedad y contiene información diversa Las herramientas Para encontrar información en las BD Para contrastar secuencias contra las BD Para exportar la información Introducción a la Bioinformática 49

50 MUCHAS GRACIAS