El arte de estudiar el desarrollo embrionario temprano: Avances y desafíos en el cultivo de embriones de rumiantes.

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1 El arte de estudiar el desarrollo embrionario temprano: Avances y desafíos en el cultivo de embriones de rumiantes

2 Introducción Retos y desafíos
Entender completamente lo que pasa en los primeros 3 a 4 días de desarrollo puesto que es difícil de acceder porque este desarrollo se da en el oviducto Retos y desafíos Tratar de cultivar post- Blastocito , cultivando estepas desarrollo embrión , reconocimiento materno gestación difícil de recrear in vito Dicho esto, el desarrollo de métodos a los embriones de cultivo in vitro hasta la etapa de blastocisto ha abierto un panorama de posibilidades para explorar cómo los embriones el desarrollo de los estudios morfológicos básicos para estudios muy sofisticados que investigan las redes de regulación transcriptómica y proteómica subyacentes que controlan el desarrollo. En esta revisión, nos centramos en aspectos específicos del desarrollo embrionario temprano y, aunque una exhaustiva reviewof la literatura no es posible, hacemos referencia otras críticas recientes a los que el lector puede referirse El cultivo in vitro brindó una serie de posibilidades para explorar como se da el desarrollo morfológico de los embriones y estudios de transcriptómica y proteómica que controlan el desarrollo.

3 Efecto de la Theriogenology en el campo de cultivo de embriones
Contribuyó al desarrollo de tecnologías en diversas áreas de reproducción influyendo en el cultivo de embriones. Desde el año 1974 se publican artículos que brindan la oportunidad de entender y conocer procesos en la producción in vitro de embriones. Teniendo en cuenta que esta edición especial conmemora el 40 aniversario de Theriogenology, es interesante resumir la contribución que el Diario ha hecho al estudio del cultivo de embriones. De alguna manera, se puede trazar el desarrollo de las tecnologías, y de hecho personalidades, en diversas áreas de la reproducción animal, incluyendo el cultivo de embriones, accionando de forma secuencial a través de las páginas y los temas de las revistas principales de la zona. Theriogenology es uno de tales revista. Al momento de escribir, una búsqueda en la base de datos PubMed con los términos 'embrión' y 'Theriogenology' revela 2420 golpes que data de El primer artículo relacionado embrión-apareció en el número 2 de la revista, titulado 'La transferencia de embriones en bovinos - experiencia de veinte y cuatro casos concluidos 'por Betteridge y Mitchell [2]. Una búsqueda en PubMed de los términos «embrión cultura" y "Theriogenology 'revela 888 hits, comenzando a principios y mediados de los años 80 (por ejemplo, [3-5]). Es importante señalar que estos primeros informes que participan en embriones vivoderived recuperaron aproximadamente 7 días después del estro. Una búsqueda de "fecundación in vitro" y "Theriogenology 'rinde 474 imparables, incluyendo algunos de los trabajos seminales que lanzaron la FIV en el ganado [6,7]. Es probablemente justo decir que el efecto de Theriogenology en el campo de las tecnologías de embriones fue facilitada por la publicación de las actas de la Sociedad de Transferencia de Embriones (IETS) como el primer número de Theriogenology a partir de 1978 (la cuarta reunión anual de lo que era entonces todavía una nueva sociedad) a 2003, ambos inclusive. Hasta cierto punto, estas dos "instituciones" crecieron juntos en los primeros años y su asociación garantiza la publicación de comentarios muy citables-actualizados sobre diversos aspectos de los embriones y la tecnología de embriones. Como señaló Betteridge [8] en su "Una historia de la transferencia de embriones de animales de granja y algunos técnicas asociadas ', estos [IETS] procedimiento »sirven como un punto de referencia con el que medir los cambios en el énfasis y la intensidad de la actividad en la transferencia de embriones a medida que pasa el tiempo".

4 Autonomía y dependencia del embrión y el tracto reproductivo
Embrión de 6 a 8 días relativamente autónomo No necesita del contacto materno Se puede desarrollar con éxito in vitro. Basado en esto en los embriones in vitro y los recuperados de donantes superovuladas se infiere que el tracto reproductivo no necesita la exposición del embrión antes del día 7 (e incluso hasta el día 16) para una preñez establecida Blastocito eclosionado El embrión depende de sustancias del lumen del útero , histotrofo que provienen del endometrio (glándulas uterinas) Crecimiento – Desarrollo. No se producen in vitro. La preparación de el útero para la implantación genera alteraciones especificas de expresión génica en el endometrio. De hecho, como ya se ha mencionado, es posible transferir un embrión a un útero síncrono 7 días después del estro y establecer un embarazo, como es de rutina en la transferencia de embriones de bovino comercial. Es solamente en asociación con reconocimiento materno del embarazo, que se produce en aproximadamente el día 16 en el ganado vacuno, que los cambios significativos en el perfil de transcriptómica son detectables entre endometrio cíclicos y embarazadas [14,15], cuando el endometrio responde al aumento de interferón-tau secretada por el conceptus filamentoso

5 Interacción entre el desarrollo del embrión y su recorrido por el oviducto
Se requieren mas estudios para entender como son las condiciones del desarrollo in vivo (oviducto y útero). Modificaciones morfológicas del embrión Activación del genoma El embrión es autónomo El tracto reproductivo debe tener exposición al embrión al día 7 (puede llegar hasta día 16) El oviducto tiene efectos positivos en la calidad del embrión

6 Proceso de implantación, elongación y reconocimiento materno
Fecundación Se da en el ámpula El oocito fecundado viaja por el cuerno 4 a 5 días hasta el útero 2. Implantación (Útero) Hay perdida de la zona Pelúcida El oocito tiene nutrición histótrofa Se da la implantación del blastocisto al día 6 -7 en el endometrio 3. Elongación Se da posterior a la implantación, al día 13 4. Reconocimiento materno Se da al día 16 por la secreción de Interferón Tau por parte del embrión Ya no hay nutrición histótrofa

7 Proceso de implantación, elongación y reconocimiento materno
Hay interacción del embrión y el endometrio

8 Mejor calidad morfológica Mejor expresión génica Criotolerancia
Interacción entre el desarrollo del embrión y su recorrido por el oviducto Mejor calidad morfológica Mejor expresión génica Criotolerancia Mejor tasa de preñez Mejor calidad de embrión Cultivo en el Oviducto ( ovejas, ganado , conejos, ratones) El transcriptoma del epitelio del oviducto bovino inicia 3 días después del estro. En regiones del istmo se tomaron embriones de 8 células y en el oviducto oocitos no fecundados: se observan grandes diferencias en la expresión génica entre istmo y ámpula Los embriones de 8 células no tuvieron efecto sobre el transcriptoma del istmo .

9 Producción in vitro de embriones
Proceso de tres etapas : Maduración in vitro, fertilización y cultivo Maduración : 90% de oocitos inmaduros son sometidos a maduración Solo el 80% son fertilizados Solo el 30 a 40% llegan a etapa de blastocito Cultivo proceso critico Oocitos de buena calidad Retos significativos asociados con la tecnología gira en el torno de la calidad del oocito y la calidad del embrión. Destacada la importancia de esta área y en reconocimiento de algunos problemas inherentes de esta tecnología en el simposio en Orlando , Florida en conjunto con la conferencia anual 32 de IETS y reportado por Theriogenology. Realizing the promise of IVF in catle: An overview Tartan temas relacionados con procedimientos de tranferencia de un mejor embrión errores en el desarrollo fetal , tranferencia y criopreservación El potencial de esta tecnología lo reporta IETS el informe Bringing the in vitro produced embryo to the commercial cattle producer: reporta en el embriones bovinos in vitro tranferidos en todo el mundo. El 85% de estos fueron tranferidos en Brasil reflejando enorme crecimiento de esta tecnologia los ultimos años. Componente crucial Los rendimientos de blastocisto in vitro de oocito de animales sacrificados rara vez supera el 40%

10 Producción in vitro de embriones Cultivo de oviducto de oveja
Como se menciono anteriormente el cultivo después de la fertilización es el mas critico en la determinación de calidad de blastocisto. Aumenta la calidad de blastocisto (resistencia de criotolerancia, tranferencia y total de embriones vivos) que los madurados in vitro. El cultivo de cigotos de mala calidad in vitro--- blastocisto de mala calidad. Cigotos de mala calidad madurados in vivo--- alta calidad. Reportes evidencian que hay cambios en expresión génica de los producidos in vitro Cultivo de oviducto de oveja

11 Producción in vitro de embriones
Los blastocistos pasan 2 días in vivo y 4 in vitro (tasas de supervivencia baja y de criopreservación) Cultivo in vitro SOF (2 a 4 días) Los que pasaron los últimos 2 días solo en SOF (tasas intermedias de supervivencia) Cultivo en oviducto de oveja a la etapa de blastocisto Los que pasaron los últimos 4 días de cultivo in vivo (tasas altas de supervivencia) expresión de pocos genes Total de tasas de desarrollo hasta el día 7 para los embriones generados in vitro en, que se transfirieron a condiciones in vivo en las etapas de cuatro células o 16- celulares fueron 24,1% y 27,5%, respectivamente. En contraste, las tasas de desarrollo totales hasta el día 7 in vitro para los embriones enrojecidas en la etapa de cuatro células 16 o de células fueron 64,4% y 68,2%, respectivamente [34]. El estudio proporciona información detallada sobre los mecanismos moleculares y las vías que están influenciados por las condiciones de cultivo alteradas durante un punto de tiempo de desarrollo embrionario específico y ponen de relieve el efecto significativo de las condiciones de cultivo in vitro durante EGA en el perfil del transcriptoma del blastocisto resultante. Estos datos contribuyen en gran medida a nuestro conocimiento de la regulación del desarrollo embrionario, y podrían utilizarse para avanzar en nuevas estrategias para modificar las condiciones de cultivo in vitro en esta etapa crítica de desarrollo para mejorar el crecimiento de embriones de buena calidad. La activación del genoma (EDA) es crucial para una buena calidad embrionaria. Estudios revelan que hay diferencias de activación del genoma tanto in vitro como in vivo Se requiere buscar estrategias para modificar las condiciones in vitro

12 Cambios en la morfología A través de la fosforilación oxidativa
Metabolismo embrionario Los embriones de preimplantación derivan su ATP Cambios en la morfología A través de la fosforilación oxidativa Energía ATP Piruvato Lactato Aminoácidos Después de la compactación de mórula, la glucosa se convierte en un importante sustrato pero en términos cuantitativos hace solamente una modesta contribución a la generación de ATP. En general, los embriones durante todo el desarrollo pre-elongación dependen de la fosforilación oxidativa mediante oxidación de los ácidos piruvato y aminoácidos para la generación de ATP para el desarrollo del embrión. Sin embargo, hay un cambio a un aumento de la contribución de la glucólisis durante la compactación y blastulación En mórula : para generar ATP utiliza glucosa en pequeñas cantidades y fosforilación oxidativa.

13 Composición del fluido de oviducto
Metabolismo embrionario Composición del fluido de oviducto Contiene: Sustratos de energía Iones y aminoácidos Glicina, alanina y glutamato La glicina la mas abundante Los embriones a medida de su desarrollo agotan los aminoácidos. Se requiere rotación de aminoácidos en etapas del desarrollo. La composición de fluido de oviducto bovino, en el que se producen las primeras divisiones celulares, ha sido relativamente bien caracterizado en los últimos años en términos de sustratos de energía, iones y aminoácidos [37-41]. La glicina, alanina, y glutamato son los aminoácidos predominantes; glicina fue la más abundante en dos a tres veces más alta que la alanina, threeto seis veces mayor que el glutamato, y hasta 30 veces mayores que los aminoácidos presentes en concentraciones más bajas, tales como asparagina, metionina y triptófano [37]. Además, las concentraciones de aminoácidos oviductal son modulados por la progesterona; nueve de 20 aminoácidos aumentó después de la suplementación con progesterona, con glicina que muestra el mayor aumento de aproximadamente dos veces [40]. l conocimiento de cómo embriones modifican su entorno de cultivo in vitro puede proporcionar información sobre las necesidades de embriones. Perdiz y Leese [42] informó de que los aminoácidos individuales se agotan a un ritmo diferente de preimplantación de embriones bovinos in vitro, lo que sugiere que los requerimientos de ácido amin cambian durante el desarrollo. Agotamiento de aminoácidos fue mayor en las etapas posteriores del desarrollo que implican un aumento en el requerimiento de aminoácidos como la que avanza el desarrollo. Posteriormente, la rotación de aminoácido ha sido utilizado para predecir la competencia de desarrollo de los embriones a partir de una variedad de especies (humanos [43-45]; cerdos [46]; y ganado [47]). Hasta hace muy poco, los enfoques para el estudio del metabolismo de embryoswere preimplantación basada principalmente en el análisis objetivo de los metabolitos individuales o seleccionados. Más recientemente, ha habido un movimiento hacia una más completa análisis del metaboloma (metabolómica), que describen los cambios en todas las moléculas de bajo peso molecular presentes en células o fluidos biológicos en una etapa de desarrollo en particular o estado fisiológico [48,49]. Esto es algo análogo al estudio de genes candidatos individuales mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa y el transcriptoma global utilizando microarrays o secuenciación de ARN tecnología. Perfiles de Metabolómica de medios de cultivo de embriones podría proporcionar un complemento útil a los métodos más tradicionales de evaluación de embriones incluyendo aspectos de la morfología, el momento de la escisión, etc.

14 Los sistemas de cultivo de embriones
Gandolfi and Moor: el cultivo de embriones mamíferos a partir de una sola célula hasta estado de blastocisto expandido es un proceso incierto. Los embriones fecundados in vitro normalmente no llegan a blastocisto: puede ser debido a la mala calidad del oocito en lugar de deficiencias en el medio de cultivo de embriones. Tervit and colleagues: fueron los primeros en reportar un cultivo exitoso de cigotos rumiantes en la etapa de blastocisto in vitro utilizando medio SOF basado en el fluido del oviducto ovino. La suplementación del SOF con suero, mejoró el desarrollo de embriones de ovejas en la etapa de blastocisto. En los 90 el co-cultivo de embriones en oviducto de ovejas era el método mas favorecido para el desarrollo de embriones in vitro

15 Cultivo in vivo: acceder al oviducto
Hecho relevante para el desarrollo del cultivo in vitro Facilitó el estudio Eyestone et al : fueron los primeros en desarrollar esta técnica Esta técnica como se mencionó anteriormente ha sido demostrada y práctica por varios autores dando como resultado un gran numero de embriones, aunque el rendimiento de blastocisto en cultivo in vivo no es superior a la in vitro. No es utilizada para diseños experimentales. Cultura de embriones bovinos en oviductos huéspedes intermedios de una variedad de especies, incluyendo ovejas, el conejo, y el ratón, se ha revisado recientemente por Rizos et al. [23]. Sin embargo, la transferencia heteróloga y la cultura de embriones (es decir, los embriones de bovino en el oviducto ovina) no es totalmente satisfactorio desde el punto de vista del diseño experimental. Recientemente, la endoscopia se ha utilizado con éxito para acceder a los oviductos de ganado para el cultivo in vivo de embriones in vitro-vencido o -fertilized en el oviducto homóloga [1,68-70]. Aunque esta técnica requiere un nivel significativo de habilidad y experiencia (actualmente sólo se practica rutinariamente por un grupo en todo el mundo para la transferencia de los embriones de trompas), ofrece muchas promesas para estudios comparativos de desarrollo del embrión en diferentes condiciones (por ejemplo, [34,73])

16 Medidas de resultado Los resultados típicos en los estudios de embriones bovinos (tasas de fertilización, tasas de división y desarrollo embrionario) la calidad de los blastocistos se evalúa utilizando criterios morfológicos no invasivos. Observando los cambios a través del tiempo para estudiar características del desarrollo. El grupo de estudio de Louvain Le-Neuve en Bélgica, utilizó un lapso de tiempo para estudiar el desarrollo del blastocisto normal en varias especies. Frozen, estudió el desarrollo en embriones bovinos y describe fase de latencia en etapas de ocho células. Holm et al, utilizó un lapso de tiempo y determinó que los que tuvieron clivaje tienen mas posibilidad de llegar a blastocisto. Otros grupos se enfocan en imágenes mas sofisticadas y algoritmos matemáticos para predecir el desarrollo de estos . Otros han utilizado medidas más invasivas que incluyen manchas y contando el número de células, evaluar criotolerancia, y el examen de los patrones de expresión de genes. El problema con muchas de estas técnicas es que implican la destrucción del embrión. En un enfoque novedoso, El-Sayed et al. [81] abordó la relación entre la transcripción el perfil de los embriones y el éxito del embarazo sobre la base de análisis de expresión génica de las biopsias blastocisto tomada antes de la transferencia a los beneficiarios. Esto permitió la identificación de genes regulados diferencialmente entre los embriones resultantes en una entrega de ternera frente a los que no resulta en un embarazo. Este enfoque se aplicó posteriormente a la evaluación del embrión humano [82]. Información sobre tasa de nacidos vivos y la salud descendencia está mayormente restringido a los seres humanos debido a la dificultad en la captura de datos posttransfer en las especies domésticas. Esos datos son, sin embargo, crítico, especialmente teniendo en cuenta la evidencia de las consecuencias a largo plazo del cultivo de embriones en la salud descendencia [53].

17 Exámenes de expresión génica Resistencias a criopreservación
Medidas de resultado Medidas invasivas Tinciones Conteo de células Exámenes de expresión génica Resistencias a criopreservación La expresión de los genes permitió identificar genes presentes en el desarrollo embrionario. Este enfoque se aplicó posteriormente a la evaluación del embrión humano [82]. Información sobre tasa de nacidos vivos y la salud descendencia está mayormente restringido a los seres humanos debido a la dificultad en la captura de datos posttransfer en las especies domésticas. Esos datos son, sin embargo, crítico, especialmente teniendo en cuenta la evidencia de las consecuencias a largo plazo del cultivo de embriones en la salud descendencia [53

18 Observaciones finales
El cultivo de embriones es uno de los retos que hay que mejorar para incrementar las tasas de producción in vitro de embriones. Falta conocer mas a fondo lo que sucede en la primeras etapas del desarrollo embrionario ( la interacción entre el embrión y la madre ). El numero de embriones bovinos en el mundo es cada vez mayor, y existe la necesidad de optimizar las condiciones de cultivo de embriones in vitro para maximizar la calidad del embrión. Observaciones finales A pesar de los retos que implica el cultivo el éxito del cultivo de embriones, en los que se pueden transferir a una receptora con tasas de preñez aceptable se ha recorrido un largo camino para comprender los factores que regulan el desarrollo embrionario temprano y su interacion. Falta conocer mas a fondo lo que sucede en las interaciones entre el embrion y el tracto de la madre Con el número de embriones bovinos transferidos en todo el mundo cada vez mayor cada año, hay una mayor necesidad que nunca para optimizar las condiciones de cultivo de embriones in vitro para maximizar la calidad del embrión, criotolerancia, y en última instancia, la tasa de embarazo después de la transferencia.