BIOTECNOLOGÍA INGENIERÍA GENÉTICA.

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1 BIOTECNOLOGÍA INGENIERÍA GENÉTICA

2 Biotecnología: Conjunto de técnicas que utilizan las potencialidades de los organismos vivos o de compuestos procedentes de ellos (enzimas, hormonas, antibióticos ….), para la obtención de productos, bienes y servicios Biotecnología tradicional: procesos de fermentación de bacterias y levaduras desde hace miles de años Biotecnología moderna: en los últimos 30 años, avances en microbiología, inmunología e ingeniería genética, con manipulación selectiva y programada de material genético Ingeniería Genética: conjunto de técnicas (Tecnología del ADN recombinante) que permiten la manipulación y transferencia de genes de un organismo a otro ( organismos genéticamente modificados). ADN recombinante: ADN formado de organismos diferentes. Nanotecnología: técnicas a escala nanométrica, con la posibilidad de fabricar materiales permitiendo manipular átomos y moléculas (Richard Feynman) Biotecnología contemporánea Clonación, nanotecnología, biomateriales, reprogramación

3 APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA

4 APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA
ROJA - Aplicaciones médicas Obtención de nuevos productos y fármacos por organismos Producción de Ac monoclonales Desarrollo de terapias génicas y celulares VERDE – Aplicaciones agrícolas y ganaderas Desarrollo de cereales resistentes a plagas Desarrollo de animales resistentes a enfermedades Desarrollo de plantas que expresen pesticidas AZUL – Aplicaciones acuáticas y marinas Uso de plantas y productos marinos para obtener nuevos fármacos Restauración y preservación de especies acuáticas Uso de genes de organismos acuáticos para obtener resistencias BLANCA – Aplicaciones a procesos industriales Producción de nuevos compuestos Desarrollo de combustibles nuevos Uso de bacterias para eliminar vertidos de petróleo

5 ORGANISMOS TRANSGÉNICOS
Organismo transgénico: es aquél que ha sufrido la alteración de su material hereditario (genoma) por la introducción artificial (manipulación genética) de un gen exógeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente. Aparentemente no existen barreras para mezclar los genes (DNA) de dos especies diferentes. Existen bioherramientas moleculares para componer y descomponer al DNA, intercambiando así fragmentos específicos de ADN de distintas especies e incluso transferirlos a bacterias. Se descubrió posteriormente que esta práctica se venía haciendo en la naturaleza de forma espontánea desde hace millones de años en los vegetales a través de la bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens: Gram- que infecta plantas a través de heridas induciendo tumores. Contiene un plásmido Ti que se integra al genoma celular (activándose por sustancias de la herida) y provoca tumores y expresión de aminoácidos especiales Las bacterias producen hoy en día, proteínas humanas por ingeniería genética como el interferón, la insulina y la hormona del crecimiento, de gran importancia en la medicina.

6 ORGANISMOS TRANSGÉNICOS Microorganismos transgénicos
Producción de alimentos Eliminación de basuras Obtención de materias primas para la industria Descontaminar lo que las industrias han contaminado Animales de granja (cerdos, ovejas, borregos) "biorreactores“ de proteínas terapéuticas humanas en su leche (antitripsina, factor VIII de coagulación…) El maíz porta un gen de la bacteria Bacillus thunngiensis para sintetizar una toxina que causa la muerte de insectos dañinos, con esta estrategia se pretende disminuir el uso de insecticidas y obtener mejores rendimientos en las cosechas, sin embargo, se ha descrito que el polen de este maíz transgénico es tóxico para las larvas de la mariposa monarca. Antitripsina : proteína que se usa en el tratamiento de un tipo de enfisema por carencia hereditaria de dicha proteína Plantas transgénicas "nueva revolución verde“ Resistentes a sequías, a herbicidas o a plagas de insectos, Maduración tardía o con características para mantener el color y sabor después de congelación Ejemplos : algodón, la soja, la papa, el tomate y al maíz

7 La Ingeniería Genética Enzimas de restricción Técnicas biotecnológicas
Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo, introduciendo genes en un organismo que carece de ellos Se realiza por Incluye Enzimas de restricción Capaces de cortar el ADN por puntos concretos Técnicas biotecnológicas Recombinación de ADN Secuenciación del ADN Reacción en cadena de la polimerasa Aplicaciones diversas Se obtiene las aplicaciones de la ingeniería genética: Son numerosas las aplicaciones prácticas y comerciales de la ingeniería genética. Se abre un campo que nos ofrece además la posibilidad de utilizar plantas y animales transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el propio planeta. ADN Recombinante Segmento de ADN extraño intercalado en un ADN receptor

8 Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética
Entre los años 70 y 80 se desarrollaron herramientas de la biología molecular y la ingeniería genética, lo que se conoce como técnicas del ADN recombinante La técnica se fundamenta en: Doble cadena del ADN Complementareidad de bases Siempre que se encuentren secuencias complementarias se unen Orden de las bases determina información de proteínas Código de transcripción universal

9 Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética
La tecnología del ADN recombinante incluye diferentes técnicas de las que destacan: La rotura específica del ADN mediante endonucleasas de restricción, que facilita el aislamiento y la manipulación de los genes individuales. La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de aminoácidos que codifica. La hibridación de los ácidos nucléicos que hace posible localizar secuencias determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucléicos. La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de ADN puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idénticas. La ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a células u organismos.

10 Enzimas: Endonucleasas de restricción
Enzimas que pueden cortar el ADN y lo hacen en secuencias concretas Enzimas que las bacterias usan para destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virus bacteriófagos

11 Enzimas: Endonucleasas de restricción
Se conocen mas de 1200 enzimas de restricción Eco RI (E. coli) reconoce secuencias GAATTC y corta entre G y A

12 Construcción de ADN recombinante
1 ADN plásmido 2 ADN extraño 3 Corte del plásmido y ADN extraño con Eco RI (endonucleasa de restricción) 4 Formación de extremos cohesivos 5 Formación de ADN recombinantes 6 Acción de ADN ligasa que sella los extremos

13 Construcción de ADN recombinante

14 Clonación del ADN La clonación de un gen consiste en introducirlo en una célula de modo que se copie y se mantenga El gen se inserta en un ADN llamado vector de clonación (plásmidos), capaz de entrar y replicarse de forma independiente en una célula huésped Resultado: ADN recombinante. Permite obtener grandes cantidades del gen insertado en la célula hospedadora adecuada apropiada Las genotecas de ADN permiten guardar indefinidamente el ADN de un organismo Un plásmido recombinante en una bacteria se replica con ella pudiendo obtenerse y aislarse millones de copias de dicho plásmido

15 Proceso de clonación de un gen en bacterias
Clonación del ADN Proceso de clonación de un gen en bacterias 1. Obtención de plásmido recombinante 2. Transformación de bacterias 3. Selección de bacterias transformadas 4. Crecimiento de bacterias transformadas 5. Aislamiento de los plásmidos recombinantes

16 Clonación del ADN Prácticas de ejercicios similares en la página indicada Ejercicios:

17 Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica que permite amplificar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Es un método alternativo a la clonación muy rápido y eficaz Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna Aplicaciones médicas de la PCR en nuevas estrategias de diagnóstico: Detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C Regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) Diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres seropositivas. Diagnóstico de hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, o reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológ icas

18 Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
El método se basa, en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces Primer paso: La muestra se calienta hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, "desnaturalización". Segundo paso: la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de oligonucleótidos (inicidores o primers) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Los “primers” son sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar Tercer paso: la ADN polimerasa produce la “extensión” de los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde (la Tª la condiciona la polimerasa

19 Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

20 Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
ADN polimerasa de E. coli se desactiva a la alta temperatura de la desnaturalización del ADN, por lo cual debía agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplazó por su equivalente de la bacteria "termófila" Thermus aquaticus

21 Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
APLICACIÓN: amplificar ADN Fragmentos de ADN antiguos (momias, fósiles..) ADN de la escena de un crimen ADN de células embrionarias para diagnóstico prenatal ADN de genes virales

22 SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Sanger
Métodos y técnicas para determinar el orden de los nucleótidos de un determinado fragmento de ADN Utilidad importante en biología básica y aplicada (forense…) Precisa gran cantidad del fragmento a determinar (clonación) Método Sanger o didesoxi: Fragmento de ADN (cantidad) Cebador en el extremo 3´ (20 bases) ADN polimerasa Desoxiribonucleótidos (A,T,C,G) Didesoxiribonucleótidos marcados radiactivamente (paran la síntesis) Cuatro tubos diferentes con: Polimerasa dATP, dCTP, dTTP y dGTP Un solo didesoxi marcado (ddATP) Se forman fragmentos de distinto tamaño terminados en A El cebador suele ser complementario del vector del fragmento desconocido, que suele ser una región cerna a la inserción del fragmento y de secuencia conocida

23 SECUENCIACIÓN DEL ADN Los fragmentos de ADN obtenidos se separan por tamaños con electroforesis Cada una de las cuatro muestras se insertan en un carril diferente del gel Terminada la electroforesis se ponen en contacto con una película fotográfica Geles de acrilamida muy finos y largos que diferencian secuencias de un nucleótido

24 SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Automático
Marcaje de ddNTP con fluorescentes distintos puediendose leer al mismo tiempo losADNs de las cuatro mezclas Comparativa de los dos métodos

25 INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
Tradicionalmente se han mejorado los cultivos por selección de ejemplares Actualmente se mejoran características con técnicas de ADN recombinante: -Plantas transgénicas- El plásmido Ti o T-ADN de Agrobacterium contiene genes (onc) que provocan una mayor producción de hormonas de crecimiento con la formación del tumor o agalla. Se eliminan de Ti los genes onc y se sustituyen por otros genes que interese clonar, se habrá obtenido un sistema eficaz para introducir ADN interesante a la planta, evitando la aparición de la enfermedad

26 INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
Actualmente se consiguen mejorar diferentes características con técnicas de ADN recombinante -Plantas transgénicas- Resistencia a herbicidas (mejora vegetal) Resistencia al glifosfato herbicida no selectivo, con gen de E. coli resistente, clonado e incorporado Resistencia a plagas, con toxina de Bacillus turingiensis Resistencia a virus, con proteínas de la cápsida de dicho virus FASES: 1. Transferencia de genes 2. Regeneración de plantas completas

27 INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
Mejora del producto (alimentos) Arroz transgénico –arroz dorado- con βcaroteno (vit A) Plantas farmaceúticas (biofarmaceútica) Producción de proteínas humanas, vacunas, anticuerpos, mas económicas y contienen mecanismos de modificación postraduccional de las proteínas, a diferencia de las bacterias

28 INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
Medio Ambiente:Utilización de organismos genéticamente modificados para eliminar contaminantes Biorremedación: bacterias modificadas para degradar hidrocarburos Bioadsorción: Bacterias modificadas que adsorben en su superficie metales pesados

29 INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
Fitorremedación: Plantas transgénicas que transforman contaminantes peligrosos en sustancias inocuas chopos modificados para acumular metales, actualmente en condiciones controladas en invernadero La fitoestabilización :plantas que inmovilizan los metales en el suelo por absorción o adsorción en las raíces. Los contaminantes permanecen retenidos bajo la superficie del suelo La fitoextracción : plantas tolerantes capaces de absorber los metales desde el suelo y acumularlos en su biomasa aérea. Posteriormente, esta biomasa es cosechada, incinerada y tratada como residuo peligroso

30 INGENIERÍA GENÉTICA y GANADERÍA
Inserción de genes en óvulos o células madre embrionarias: Quimeras transgénicas sólo sobre algunas células del embrión Organismos transgénicos todas las células modificadas Células modificadas Células no modificadas Transmisión a la descendencia, órganos y tejidos para trasplantes 1.Secuencia hibrida de gen de interés y secuencia promotora de una proteína de la leche 2. Introducir el transgén en óvulo fecundado 3.Implantación en la hembra que lo expresará junto con la leche Ejs.: α1-antitripsina, factor VIII,…

31 INGENIERÍA GENÉTICA y MEDICINA
APLICACIONES Obtención de productos farmacéuticos Medicina forense Marcadores genéticos Huella genética Insulina Interferón H. De crecimiento Factor VIII Terapia génica Inserción de genes funcionales para corregir un defecto genético Diagnóstico de enfermedades Marcadores: pequeñas diferencias en zonas concretas del ADN de diferentes individuos que sirven para su identificación Uno de los mas utilizados so repeticiones cortas en tándem que en cada individuo varía el nº de repeticiones Detección en personas o fetos enfermedades hereditarias por técnicas de ADN recombinante En células germinales En células somáticas

32 Producción de insulina humana
La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), que están codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener en cultivos bacterianos separados. Proteína de fusión con subunidad B del gen de la insulina Transformación en E. coli Proteína de fusión con subunidad A del gen de la insulina Promotor Extracción de las proteínas de fusión Separación de los polipéptidos A y B Subunidad A del gen de la insulina Formación de insulina activa INSULINA: Una de las primeras aplicaciones prácticas de la ingeniería genética fue la utilización de bacterias de crecimiento fácil para producir proteínas, como por ejemplo la insulina, vital para la regulación del metabolismo de los glúcidos en el organismo. La diabetes, una enfermedad que se caracteriza por la disfunción en la producción de insulina, afecta a millones de personas. El tratamiento de esta enfermedad se realizaba utilizando insulina comercializada, procedente del páncreas de terneros o de cerdos, que no es tan efectiva como la humana. Además, el proceso de aislamiento es caro y complejo. Actualmente se produce insulina humana utilizando microorganismos: La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), codificados por partes separadas de un mismo gen (conectados por puentes disulfuro), y que codifica la preproinsulina, un polipéptido más largo que contiene una secuencia señal, los polipéptidos A y B de la molécula de insulina activa, y un polipéptido de unión que está ausente en la insulina madura. La producción de insulina humana en bacterias se realiza siguiendo dos caminos: 1. Producción de proinsulina y conversión en insulina por métodos químicos. 2. Producción de las cadenas A y B, en dos cultivos bacterianos separados, y unión de ambas cadenas por procedimientos químicos. Debido a que la molécula de insulina es bastante pequeña, en cualquiera de los dos casos resulta más conveniente sintetizar químicamente la secuencia adecuada de ADN que intentar aislar el gen de la insulina a partir de tejido humano. Promotor Subunidad B del gen de la insulina

33 1: ADN sintético que codifica para la cadena A de la insulina humana, se inserta en un plásmido bacteriano. Se fabrica también ADN para la cadena B, y se inserta en otro plásmido. En ambos casos al lado del gen bacteriano para la β-galactosidasa. 2: Los plásmidos se han introducido (por separado) en células de Escherichia coli. Al expresarse, dan lugar a una proteína de fusión, β-galactosidasa unida a insulina (A o B) mediante un residuo de metionina. 3: Ambas proteínas de fusión se extraen y se purifican por separado, tratándose con BrCN, que destruye la metionina, quedando libres las cadenas de insulina. 4: Se juntan las cadenas A y B, y mediante procedimientos químicos (oxidación) se establecen entre ellas puentes disulfuro, obteniéndose insulina en su forma final.

34 fin

35 CONSTRUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE

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