TECNICAS HISTOLOGICAS

Presentación del tema: "TECNICAS HISTOLOGICAS"— Transcripción de la presentación:

1 TECNICAS HISTOLOGICAS

2 TECNICAS HISTOLOGICAS
Se define Técnica Histológica como el conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al microscopio. Las Técnicas Histológicas incluyen los siguientes pasos: Obtención de la Muestra. Fijación de la Muestra. Deshidratación. Inclusión en Parafina. Obtención de cortes. Coloración. Montaje

3 OBTENCION DE LA MUESTRA
El material a utilizar puede ser extraído de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano. Fases en la obtención de material animal: Muerte del animal. Extracción de los órganos. Reducción a piezas.

4 Obtención de material humano: De tres fuentes puede provenir el material humano: Necropsias o Autopsias: Son las piezas que se obtienen de un cadáver. Biopsias: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico. - Piezas operadas: Los tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos inflamados, pero, sólo servirán para anatomía patológica.

5 Autopsia Forense o Necropsia:
Necropsia Médico Forense: Es el procedimiento médico encaminado a que en base a la revisión interna y externa del cadáver sea posible establecer la causa de muerte del occiso relacionado con una averiguación previa y en auxilio de una investigación judicial. Es recomendable que en los siguientes casos se efectué la necropsia médico legal: 1.- En todas las muertes violentas incluyendo aquellas en que este la duda de violencia. 2.- Personas que fallecieron en áreas de reclusión y/o seguridad y que estuvieron bajo responsabilidad de servidores públicos de seguridad pública y procuración de justicia. 3.- Muertes en la vía pública. 5.- Muertes sospechosas de haberse producido por violación a los derechos humanos.

6 Requisitos para la práctica de la necropsia:
Orden escrita para la práctica del estudio de necropsia firmada por la Autoridad Ministerial. Copia de la Averiguación Previa. Acta médica. En caso de haber recibido atención médica horas o días previos a su muerte, resumen clínico de las intervenciones y tratamientos a las que fue sometido. Orden de entrega a los familiares y de aviso a la Autoridad del Registro Civil. Objetivos a determinar: 1.- La causa de muerte (Cuando es posible). 2.- La hora aproximada de la muerte. 3.- La identidad del cadáver. 3.- Descripción detallada de las lesiones externas e internas, así como de los hallazgos de necropsia, siguiendo los protocolos internacionalmente aceptados

7 Autopsia Clínica: Es generalmente realizada para determinar no sólo la causa de la muerte, que en muchos casos es conocida, sino todos los procesos patológicos que afectaban al individuo. Tiene propósitos de estudio e investigación. Es solicitada por los facultativos que atendieron al paciente y debe ser autorizada por los familiares.

8 FIJACION DE LA MUESTRA Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que tienen varias finalidades: Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo. Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste. Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos. Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte de la célula.

9 La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre las proteínas. Regla de Oro para la Fijación La mejor fijación es cuando a pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijación. Tamaño de la Muestra. El tamaño de la muestra debe de ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual de va a utilizar.

10 FIJACION (CONTINUACION)
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los tejidos. FIJADORES QUÍMICOS Son los más utilizados; pueden ser: - fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y - fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitución. FIJADORES SIMPLES: a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos. b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica. c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).

11 FIJADORES COMPUESTOS:
En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética. b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética. c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética. e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico. FIJADORES FÍSICOS: 1. Desecación. 2. Calor seco. 3. Calor húmedo. 4. Frío. 5. Congelación y desecación.

12 Para Microscopia Electrónica se usan:
Glutaraldehído al 2.5%, Paraformaldehído, Tetróxido de Osmio y Permanganato de Potasio Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros fijadores como el formaldehido, son muy enérgicos en su acción con las proteínas. Actúan como colorantes electrodensos, permitiendo observar al tejido con el haz de electrones. Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un tampón a pH 7.4, evita la violenta desnaturalización de las proteínas guardando detalles finos de la célula. Es el más usado en Microscopia Electrónica.

13 DESHIDRATACION Y ACLARAMIENTO
DESHIDRATACIÓN Después que la muestra ha sido fijada se elimina el fijador y se deshidrata. Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona. Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar el agua. Esto se hace por que si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría.

14 ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida). La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol. Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción. También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento. NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.

15 DESHIDRATACION E INCLUSION EN PARAFINA
A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme. Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y parafina. El objeto de la inclusión es: Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte. La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.

16 Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina. Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco.

17 OBTENCION DE CORTES El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO. Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento o enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión, nos auxiliamos con la Técnica de Congelación de Tejidos. Un tejido congelado, es los suficientemente duro para ser cortado. Se sumerge la muestra de tejido en Nitrógeno líquido para tener una congelación rápida.

18 Luego se corta con un aparato especial denominado MICROTOMO DE CONGELACIÓN, existe un aparato más elaborado y eficiente para los cortes de congelación llamado CRIOSTATO. La ventaja de esta técnica es que los cortes que se obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el diagnostico de material patológico, tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operación. Para Microscopia Electrónica se requieren cortes más delgados (denominados ultra finos) de aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5 mm. de lado medio. Para esto se utiliza un MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O DIAMANTE. Una vez preparados, se montan sobre rejillas de cobre con un diámetro de 3mm.

19 COLORACION O TINCION DE LA MUESTRA
Las tinciones son combinaciones de colorantes ácidos y básicos que permiten obtener suficiente contraste de color en los cortes histológicos comunes. A continuación presentaremos una lista de las tinciones más comunes: Hematoxilina y Eosina: La hematoxilina al ser básica tiñe ácidos de color morado (núcleos con DNA y RNA), mientras que la eosina es un ácido y tiñe bases de color rosado (citoplasma). PAS (Ácido Peryódico de Schiff): Tiñe carbohidratos (mucopolisacáridos) de color rojo, por ejemplo las células caliciformes en el intestino. Tricrómico de Masson: Tiñe de color azul la colágena, de rojo la queratina, y de morado los núcleos (muy utilizada para los cortes de piel). Nissl: Tiñe de color morado el retículo endoplásmico rugoso y los corpúsculos de Nissl en las neuronas.

20 Pentacrómico de Movat: Tiñe de amarillo la colágena, los músculos de color rojo, de azul mucopolisacáridos, la elastina de color negro, y los núcleos de morado. Wright: utilizado en frotis sanguíneos, permite observar todas las células sanguíneas, coloreando los eritrocitos de color rosado, con un centro claro. Permite observar todas las células sanguíneas, coloreando los eritrocitos de color rosado, con un centro claro. Reyes Mota: Tiñe la elastina de color morado. Además de las tinciones comunes tenemos a la inmunohistoquímica, la cual se basa en la utilización de anticuerpos específicos, los cuales marcan o resaltan las estructuras que se desean ver.

21 EJEMPLOS DE COLORACIONES
Tricrómico de Van Gieson. Resultados: Células: - Núcleos: negro - azul - Citoplasma: amarillo Colágeno: rojo intenso Piel humana, objetivo 40X Coloración Hematoxilina-Eosina Resultados: Núcleos y material basófilo en tonos de morado. Citoplasma en tonos de rosado Glándula salival Sublingual, objetivo 40X Impregnación Argéntica Resultados: Célula (neurona): -Soma y prolongaciones (dendritas, axón) de color pardo oscuro Corteza cerebral de rata, objetivo 40X

22 Corte de piel con tricrómico de Masson
Ácido Periódico de Schiff (PAS) Hematoxilina Resultados: - Núcleos: azul -Células caliciformes y Chapa estriada en fucsia Intestino delgado, objetivo 40X Corte de piel con tricrómico de Masson

23 MONTAJE Y OBSERVACION EN EL MICROSCOPIO
Para observar adecuadamente los cortes teñidos con el microscopio óptico, se ha de proceder a cubrir las preparaciones mediante un cubreobjetos. Para ello se requiere la utilización de una sustancia cementante o medio de montaje. Si durante la técnica de tinción se han empleado colorantes hidrosolubles, deben utilizarse medios de montaje no-acuosos, es decir hidrofóbicos. Si por el contrario, los colorantes utilizados son no- iónicos, es preceptivo utilizar un medio de montaje hidrosoluble. Antes de su aplicación, los cortes deben hidratarse convenientemente.