Curso Optativo de grado “Estudio interdisciplinario de la Enfermedad de Chagas” PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE.

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1 Curso Optativo de grado “Estudio interdisciplinario de la Enfermedad de Chagas”
PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS DRA ALICIA LAPIERRE Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional de San Luis

2 Diagnóstico de laboratorio
La Enfermedad de Chagas es una de las endemias más importantes en nuestro país, siendo uno de los problemas de Salud Pública de mayor distribución en América Latina. Para su correcto diagnóstico se deben evaluar los datos clínicos, de laboratorio y epidemiológicos. El laboratorio juega un rol fundamental y muchas veces determinante en el diagnóstico de la infección.

3 DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Es muy importante p/el control y tratamiento de la enferm. de Chagas, aportando información para el desarrollo de medidas de control de la endemia.- Los mét. de diagnóstico se basan en procedimientos que ponen en evidencia: el parásito (parasitológicos) o que permiten detectar los Ac contra el mismo (serológicos).

4 LA DEMOSTRACIÓN DE LA PRESENCIA DEL PARÁSITO ES EL DIAGNÓSTICO INDISCUTIBLE.
PERO SOLO ES POSIBLE EN: ETAPA AGUDA, PUES EN: LAS INDETERMINADAS Y CRÓNICAS SU SENSIBILIDAD ES BAJA (<50 %)

5 Diagnostico de laboratorio
LA MEJOR PRUEBA DE LABORATORIO PIERDE SU UTILIDAD CUANDO SE REALIZA EN EL MOMENTO INADECUADO Por esto es fundamental conocer tres aspectos: Cuándo realizar un análisis ??? Qué análisis realizar ???? Cuales son los objetivos del análisis???? Evitar la realización de estudios parasitológicos y/o serológicos en un momento inadecuado!!! falsos negativos!!.

6 Diagnóstico de laboratorio
La enfermedad de Chagas presenta tres etapas clínicas: Aguda Crónica sin compromiso orgánico Crónica con compromiso orgánico Debemos tener en cuenta el período ventana que se produce cuando T.cruzi ingresa al organismo, cumple sus primeros ciclos de desarrollo en el hospedador, que abarca entre 7 a 15 días, período después del cual recién se pueden detectar parásitos circulantes y posteriormente anticuerpos contra el parásito.

7 Diagnóstico de laboratorio
Luego del período de Ventana se presentan parasitemias, las que van disminuyendo a medida que transcurre el tiempo, hasta hacerse mínimas o aleatorias. ETAPA AGUDA El diagnóstico de laboratorio debe centrarse en la búsqueda del parásito. MÉTODOS PARASITOLÓGICOS

8 Diagnóstico de laboratorio
ETAPA CRÓNICA El diagnóstico se realiza mediante la demostración de anticuerpos específicos anti Trypanosoma cruzi. MÉTODOS SEROLÓGICOS

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10 Etapa Aguda Métodos Parasitológicos

11 ETAPA AGUDA En esta etapa deben realizarse fundamentalmente los
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS, los cuales pueden ser realizados por distintos procedimientos analíticos, dependiendo de la disponibilidad de recurso humano capacitado y equipamiento en cada laboratorio. La DETECCIÓN DEL PARÁSITO, como en toda enfermedad infecciosa, es el único parámetro de CERTEZA DIAGNÓSTICA.

12 métodos parasitológicos
GOTA FRESCA GOTA GRUESA TÉCNICA DE CONCENTRACIÓN DE STROUT MICROSTROUT / MICROMÉTODO HEMOCULTIVO XENODIAGNÓSTICO

13 Diagnóstico de laboratorio- ETAPA AGUDA métodos parasitológicos-GOTA FRESCA
Aumentar irrigación gota de citrato al 2%) 10x / 40x 45 minutos por lo menos 3 portas Trypanosoma cruzi Sensibilidad 50%

14 Diagnóstico de laboratorio- ETAPA AGUDA métodos parasitólogicos-GOTA GRUESA
Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos. Lavar y secar 1-2min Dejar secar Desfibrinar Colocar 1 a 3 gotas objetivo de 100x aceite Trypanosoma cruzi Sensibilidad 50%

15 DIAGNOSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDA METODOS PARASITOLOGICOS-STROUT
Suero p/reacc. serológicas 600 rpm 2 min. 2500 rpm 10 min. 5-10 mL Coag. Sedimento Tº amb Objetivos de 10x y 40x (45 minutos) Sensibilidad 95%

16 Diagnóstico de laboratorio- ETAPA AGUDA métodos parasitológicos-MICROHEMATOCRITO
BIOSEGURIDAD Cerrar extremo con plastilina Cortar 45 segundos a 5000 rpm 6 a 9 capilares de microhematocrito heparinizado Objetivos de 10x y 40x (45 minutos) Sensibilidad 90 a 95%

17 La técnica de MICROHEMATOCRITO NO ES RECOMENDABLE
Puede brindar falsos resultados negativos: Si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la posibilidad de que los parásitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo de no ser visualizados. Que el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difícil de observar la presencia del parásito en la interfase, entre la capa de glóbulos blancos y el suero. Si el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se coloca el cubreobjeto, no tiene una adecuada adherencia y dificulta la observación. Por razones de Bioseguridad del operador: Ya que para su observación deben cortarse aproximadamente 7 capilares, para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los guantes del operador e incluso herirlo, sin que éste lo perciba, pudiendo adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc.

18 Diagnóstico de laboratorio- ETAPA AGUDA métodos parasitológicos-hemocultivo
Consiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi.

19 Existen técnicas estandarizadas con sangre heparinizada, recolectada en condiciones de estricta asepsia, en medio monofásico (Infusión Cerebro Corazón) y bifásico (pico de flauta de agar sangre). Se incuba a 28ºC y se realizan observaciones microscópicas y subcultivos periódicos, desde los 7 y hasta un máximo de 60 días.

20 El método del hemocultivo es de elección por su menor agresividad para los pacientes, fundamentalmente en la población neonatal, mayor precocidad de resultados y menor requerimiento en infraestructura.

21 Diagnóstico de laboratorio- ETAPA AGUDA métodos parasitológicos-xenodiagnóstico
Consiste en amplificar el nº de parásitos utilizando al vector. Se utilizan ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio.

22 Se realiza con la aplicación de 4 cajas con 20 ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio, con 20 días de ayuno, cubiertas con una gasa, sujetada con una banda elástica. Se sujeta al antebrazo durante 15 o 20 minutos.

23 Luego se deja a 28ºC y 70% de humedad durante 30 o 60 días
Luego se deja a 28ºC y 70% de humedad durante 30 o 60 días. El material se obtiene por compresión de la zona abdominal del insecto, entre dos pinzas, sobre un portaobjetos, y se lo diluye con solución fisiológica estéril, luego se agrega un cubreobjeto y se observa con objetivo de 40x , recorriendo aproximadamente 300 campos en guarda griega.

24 Diagnóstico parasitológico
Enfermedad de Chagas Diagnóstico parasitológico ventajas desventajas Strout, Microstrout Resultado precoz Certeza diagnóstica Sencillez operativa Bajo costo Sensibilidad operador dependiente Hemocultivo Elevada sensibilidad Facilidad en la obtención de la muestra Requiere experiencia del operador Contaminaciones Xenodiagnóstico Gold standard Método cruento Reacciones alérgicas Infraestructura compleja

25 PCR: Fue un extraordinario avance científico, pero presenta resultados controvertidos en el diagnóstico de Chagas, actualmente no esta validada para diagnóstico clínico. Hasta su estandarización y validación, sólo se utiliza en investigación.

26 % de los casos durante el período agudo y en la infección congénita.
En resumen, los métodos parasitológicos clásicos: examen en fresco, Strout o microStrout y Hemocultivo empleados secuencialmente, permiten llegar a un diagnóstico de certeza en aprox. el 100 % de los casos durante el período agudo y en la infección congénita.

27 En el período indeterminado o crónico los parásitos circulantes son
escasos y difícilmente detectables, por lo cual deben utilizarse las pruebas serológicas.

28 Etapa Crónica Métodos Serológicos

29 Diagnostico de laboratorio
ETAPAS INDETERMINADA y CRÓNICA demostración de Ac específicos anti Trypanosoma cruzi.

30 La serología debe interpretarse siempre en términos de probabilidad y en el contexto de la epidemiología y la clínica El diagnóstico serológico debe efectuarse por dos reacciones en paralelo (par serológico), y en caso de discordancia, se debe recurrir a una tercera prueba para definir el resultado.

31 El concepto básico que debe tenerse en cuenta es que lo que se busca no es el parásito y, por lo tanto, sus resultados nunca proporcionan certeza diagnóstica y deben medirse en términos de probabilidad.

32 Para que las probabilidades de éxito en el diagnóstico serológico se acerquen a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente El MÉTODO A EMPLEAR, EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA e INTERPRETAR ADECUADAMENTE LOS RESULTADOS.

33 métodos serológicos - HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI) - ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay) - INMUNOFLUORESCENCIA(IF) Los métodos actualmente validados son:

34 Diagnóstico de laboratorio- ETAPA CRÓNICA métodos serológicos - HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
Se basa en la propiedad que tienen las proteínas de adsorberse sobre la superficie de glóbulos rojos de carnero o de ave modificada químicamente y actuar como soporte del antígeno. Consiste en placas de poliestireno con Ag solubles del parásito pegados , se coloca suero de pacientes que, si tienen Acs se unen a los antígenos pegados, los glóbulos rojos se aglutinan.

35 Luego se agrega un reactivo constituído por anticuerpo anti inmunoglobulinas humanas marcado con una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y posteriormente, se agrega un sustrato de la enzima que, si en la fase sólida se encuentra el doble complejo antígeno- anticuerpo del paciente- anticuerpo marcado, desarrolla un color cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpos del paciente y a la afinidad de los mismos.

36 Diagnóstico de laboratorio- ETAPA CRÓNICA métodos serológicos - INMUNOFLUORESCENCIA
Tiene un fundamento similar al método de ELISA, con algunas diferencias importantes. La primera es que el antígeno es particulado (el parásito entero fijado con formaldehído o glutaraldehído). La segunda diferencia radica en que el segundo anticuerpo está marcado con una sustancia fluorescente, ususalmente isotiocianato de fluoresceína y, por último, la lectura se realiza en un microscopio equipado con luz UV.

37 Los métodos serológicos emplean antígenos de composición muy variable y ninguno alcanza por sí solo el 100% de efectividad en el diagnóstico. Se deben utilizar dos técnicas con antígenos diferentes y distintos principios que permita alcanzar un rango de sensibilidad entre 98 y 99.5%. Las duplas serológicas que garantizan este rango de sensibilidad podrían ser: ELISA + HAI ELISA + IF HAI + IF

38 Actualmente, la reacción más sensible es ELISA que, por otra parte, si se cuenta con un espectrofotómetro de lectura vertical (lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad. Permite procesar elevado número de muestras.

39 La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulación del nivel de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y también es adecuada para procesamiento de elevado número de muestras.

40 Respecto a la IF, sin dudas se trata de una buena metodología, pero requiere experiencia del operador y depende de la subjetividad del mismo. Por otra parte, el equipamiento requerido no está al alcance de pequeños laboratorios y no es una técnica adecuada para procesar elevado número de muestras.

41 CONCLUSION El diagnóstico de la infección chagásica está protocolizado, no requiere equipamiento sofisticado y su correcta realización e interpretación es de invalorable utilidad clínica y epidemiológica. Un diagnóstico correcto y oportuno en infección aguda o congénita, o durante los primeros años de vida, permite el tratamiento con alta eficiencia terapéutica y en el paciente crónico, su seguimiento evolutivo.

42 A mas de 100 años de haber sido descripta por primera vez, esta infección continúa siendo un grave problema de salud pública en muchos países de América Latina. Por pérdida de calidad de vida, por discapacidad, el Chagas ocupa un lugar de importancia entre las enfermedades infecciosas en América. 42

43 Bibliografía Consultada
- De Rissio AM, Cura E, Esteva M, Sosa Estani S, Segura EL y col. Manual de Laboratorio. Enfermedad de Chagas y otras Parasitosis. Instituto Nacional de Parasitologìa “Dr. Mario Fatala Chabén”, Ministerio de Salud y Acción Social de la Nación, 8ª Edición, 1996 - Ministerio de Salud de la Nación. Normas para el diagnóstico de la infección por T. cruzi. Buenos Aires: Resolución 523, Ministerio de Salud de la Nación, 1997 - Ministerio de Salud de la Nación. Plan para el control de la Enfermedad de Chagas en Argentina. Buenos Aires: Programa Nacional de Chagas, Ministerio de Salud de la Nación, 2010 - Normas para el diagnóstico de la infección por T. Cruzi.- Instituto Nacional de Parasitologìa “Dr. Mario Fatala Chabén”, 2012

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