Journal of Computer-Aided Molecular Design 17: 673–686, 2003. © 2004 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands. 673 Sampling and convergence.

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1 Journal of Computer-Aided Molecular Design 17: 673–686, 2003. © 2004 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands. 673 Sampling and convergence in free energy calculations of protein-ligand interactions: The binding of triphenoxypyridine derivatives to factor Xa and trypsin Alessandra Villa, Ronen Zangi, Gilles Pieffet & Alan E. Mark The Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, Department of Biophysical Chemistry, University of Groningen, Nijenborgh 4, 9747 AG Groningen, The Netherlands Received 21 July 2003; Accepted in revised form 26 September 2003

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3 Union de 10 derivados de trifenoxipiridina a dos serinproteasas( factor Xa y tripsina) fueron usadas para analizar factores relacionados al calculo de la energia libre basandose en dinamica molecular Desafio del uso de estos inhibidores: calculo de energia explicita, la mutacion de un componente a otro involucra a 19 atomos, los diversos modos de union alternativos

4 ► En este estudio se demostro que era posible la obtencion de resultados con una alta convergencia(5 – 10 kj/mol) en un tiempo de nanosegundos ► Esto es posible usando potenciales que faciliten la creacion y delecion de atomos por eleccion muy cuidadosa del camino de la mutacion ► Se demuestra que a pesar de que los recursos informaticos estan lejanos de ser los mas adecuados los calculos de energia explicita pueden ser exitosamente aplicados en el disenio de drogas

5 ► La estimacion de las diferencias en energia libre es central en el proceso de un disenio molecular factible ► Comportamiento de fases ► Constante de asociacion ► Constante de disociacion ► Solubilidad ► Coeficiente de Adsorcion ► Equilibrio conformacional

6 ► Las diferencias entre energia libre estan relacionadas con la probabilidad relativa de encontrar un sistema en un estado microscopico dado ► Muchos acercamientos empiricos han sido desarrollados para estimar la interaccion o energias libres de union entre proteinas y sus ligandos ► Pueden ayudar a diferenciar las energias libres entre dos estadios de un sistema estimando los valores de estas directamente ► Dificultad: alto costo computacional, requerimientos de una alta tecnologia

7 ► Se evaluaron las afinidades relativas de union de los 10 inhibidores de 2 serin proteasas factorXa y tripsina que compartian secuencias y homologia estructural ► Es importante que los inhibidores ha ser estudiados se unan de forma altamente selectiva al factor Xa y no a otras serin proteasas ► Templado:Trifenoxipiridina, los inhibidores producidos difieren en el numero y tipo de sustituyentes de dos de los tres grupos fenil

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9 ► Los Inhibidores difieren significativamente entre ellos y la transformacion de un compuesto blanco en otro involucra la mutacion de muchos sitios que se ven en los calculos de energia libre ► Al no existir datos experimentales, no se puede discutir cual es el error absoluto en los calculos obtenidos, solo se estudia, la consistencia de los resultados obtenidos basandose en en la energia libre entre dos estados, mediante estos calculos se pudo hacer un listado de los 10 inhibidores

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11 METODOLOGIA ► No se tenian datos estructurales de los 10 inhibidores unidos a factor Xa, se utilizaron las estructuras cristalograficas del factor Xa con 2,6 difeniloxypiridina y tripsina con 1QB1 ► La estructura del Xa esta compuesta por dos cadenas polipeptidicas, sin embargo solo la cadena primaria es la que contiene el sitio de union al inhibidor por lo tanto en los calculos realizados se utilizo unicamente esta cadena asi se pudo minimizar el tamanio del sistema ► La estructura inicial del factor Xa y Tripsina unida al I1 fueron construidas por superimposicion de los atomos de nitrogeno del grupo aminometil y los atomos de nitrogeno del grupo de imidazolil del inhibidor en los atomos correspondientes en la estructura del templado ► La conformacion de I1 usado para este procedimiento fue tomado por la simulacion de un inhibidor aislado en agua ► Las estructuras del factor Xa y tripsina en complejo con los inhibidores I2-I10 fueron derivados del I1 por mutaciones en R1 y R2 durante los calculos de energia libre

12 Mutaciones ► Los inhibidores se dividen en 2 grupos dependiendo de la naturaleza de sus sustituyentes inhibidores I1-I6, tienen el mismo R2 mientras inhibidores I2 y I7-I10 tienen el mismo R1, el I2 pertenece a ambos grupos y fue usado como referencia ► Las mutaciones fueron esogidas con el fin de maximizar el numero de posibles cierres de ciclos mientras se minimizo el tamanio mismo de la mutacion( solo mutando un grupo determinado) ► El cierre de ciclo puede proveer una importante vision del grado de convergencia

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15 Force field ► ► The GROMOS96 (43a2) force field fue usado para tanto la proteina como el inhibidor cuando los parametros no estaban disponibles en un campo de fuerza standard para la determinacion de ciertas interacciones ► ► Los parametros fueron obtenidos por calculos ab initio ► ► El principal proposito en el desarrollo de parametros adicionales era mantener la compatibilidad con el resto del campo de fuerza ► ► Los parametros que no estaban disponibles incluian el potencial de torsion entre el anillo fenoxy y la pyridina y el potencial definido mpor el carbono aromatico y un eter oxigeno como atomos centrales fuer determinado mediante encajar un potencial empirico al potencial energetico ab initio ► ► La superficie del sistema de modelo termico, p-phenylpiridine. ► ► Las cargas atomicas fueron derivadas mediante una escala de las cargas atomicas obtenido mediante el fitting de RHF/6-31G* por electrostatica molecular

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