Luciano Moffatt INQUIMAE

Presentación del tema: "Luciano Moffatt INQUIMAE"— Transcripción de la presentación:

1 Luciano Moffatt INQUIMAE
Tópicos de Fisicoquímica en Sistemas Biológicos Canales iónicos Luciano Moffatt INQUIMAE 16 de noviembre 2004

2 Qué son los canales iónicos?
Cuáles son sus roles fisiológicos? Cómo se los estudia?

3 Que son? Proteínas de membrana que tienen permeabilidad selectiva por ciertos iones. Son multiméricas con varios dominios trans-membrana Comprenden de: Poro Compuerta (gate) Filtro (selectivity filter) Sensor (voltage, neurotransmisor, etc) Mecanismo de transduccion

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6 Que no son? Transportadores (2 gates)
Receptores metabotropicos (no ionotropicos)

7 Bomba sodio

8 Ionotropico vs metabotropico

9 Que hacen? Son responsables de la permeabilidad selectiva de la membrana Permiten cambios rápidos en la concentración de iones (calcio) y del potencial de membrana (transmisión de la información a distancia).

10 Que no hacen? Mantener la concentracion diferencial ambos lados de la membrana, esto lo hacen las bombas

11 Como se los estudia Se mide la corriente que pasa a través de ellos. Como solo se puede medir la corriente total, se deben eliminar otros canales. Dos estrategias Se buscan células que expresen el canal de interés, los otros canales se bloquean farmacológicamente Se usan células que expresen naturalmente pocos canales, se sobre-expresa el canal de interés. (Util para mutagénesis).

12 Como se los estudia Se miden diferentes parametros:
Conductancia Permeabilidad relativa a distintos iones Probabilidad de apertura en distintas condiciones Se analiza la modulación por distintos factores (potencial de membrana, concentracion de agonistas, ph, concentracion de iones, temperatura, etc) Se analizan transitorios y situaciones de steady state

13 Sistemas de expresion Se tiene el gen o genes clonados y se los expresa en algun sistema, tipicamente: Oocytos de Xenopus: se inyecta RNA. Celulas HEK-293: se transfecta con el plasmido con un promotor fuerte. Se usa lipofectamina.

14 Oocytos de Xenopus Lupa, no microscopio Expresion a 20C
Corrientes grandes: µA Aplicación lenta del agonista (10ms-1s) Voltage clamp lento

15 Celulas HEK 293 Mas parecido al mamifero: expresion a 37C Microscopio
Patch clamp: voltage clamp rapido Uso de EGFP para detectar la eficiencia de la transfeccion Aplicación del agonista hasta 100µs

16 Sistemas nativos Cultivos primarios: modificaciones post-traduccionales, distribucion celular Fetas de tejidos (slices): conexiones sinápticas In vivo: patrones de actividad sinaptica

17 Voltage clamp

18 voltage clamp vs current clamp
Voltage clamp: como las propiedades del canal dependen del potencial de membrana, conviene mantenerlo constante. Current clamp: estudiar los canales en un contexto natural

19 Modelo RC de la membrana

20 Capacidad de las membranas: 0.01pF/µm2
Densidad de canales: /µm2 1 canal-0.5ms En voltage clamp a Vm=cte la capacidad de la membrana no influye Se corrige la capacidad para saltos de Vm

21 Patch clamp Gigaseal Canal unico

22 Whole cell vs patch Whole cell: mas fisiologico.
Isolated Patch: mas versatil (1 µm2)

23 Canal unico

24 Equipamiento

25 Amplificador de patch

26 Ejemplo de estudio de canal unico

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30 Estrategia de analisis cinetico
Obtener datos de canal unico y/o de macrocorrientes en distintas condiciones de Vm, concentracion de agonista, etc Proponer un modelo cinetico markoviano Optimizar los parametros del modelo que minimicen la suma de los cuadrados de los residuos. Si la prediccion no resulta buena cambiar el modelo cinetico.

31 Modelos cineticos Ver apunte de Sigworth

32 Ejemplo de modelo cinetico

33 Ejemplo de estudio de macrocorrientes

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35 Alosterismo

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38 Performance de modelos

39 Resumen Mediante los modelos cineticos se puede describir y predecir cuantitativamente el comportamiento de un canal en condiciones arbitrarias de los factores que definen su comportamiento (Vm, concentracion, etc) El paso siguiente hacia arriba es construir una celula virtual donde se puede predecir la interaccion entre distintos canales Para abajo se puede tratar de determinar la base estructural de las diferentes constantes cineticas obtenidas.