Preparación Células Competentes

Presentación del tema: "Preparación Células Competentes"— Transcripción de la presentación:

1 Preparación Células Competentes
Dr. Jesús Lee-Borges Dr. José M. Planas Dra. Liza Jiménez Universidad de Puerto Rico – Aguadilla Departamento de Ciencias Naturales

2 Objetivos Repasar principios básicos y protocolo de preparación de bacterias competentes. Preparar bacterias competentes. Realizar protocolo de transformación.

3 Pasos a seguir para la clonación:
Aislamiento Amplificación (PCR) Digestión ER : Plásmido y DNA a clonar Ligación (in vitro, ligasa) Transformación (bacterias competentes) Selección “Screening” Para que quiero transformar?

4 Células competentes capaces de permitir la entrada de DNA a través de su membrana Cambios en las membranas que permiten el paso de moleculasd de DNA exogenos

5 Maneras de obtener bacterias competentes
Comerciales Preparando “stocks” de manera local Companias que venden cepas creadas con especificiaciones Hoy nosotros vamos a hacer una cepa de ellas.

6 Factores críticos en obtener transformación
La pureza de los reactivos usados en los buffers de transformación La etapa de crecimiento de las células Bacterias crecidas del “stock” original y almacenadas a -70 C Lag  Log  Plateau La limpieza del equipo usado Presencia de detergentes Porque no salen los exptos?: pureza/ No tenemos una cepa original. Control sobre equipo usado, detergentes, agua, etc Detergentes ..membranas.. Fosfolipidos,… etc

7 Métodos para obtener células competentes
Electroporación (electrotransformación) Neuman et al. 1982, Potter et al. 1984, Fromm et al. 1985, Chu et al. 1987) Mas fácil, mas eficiente Transformación química CaCl2

8 Electroporación Aplicación de un elevado voltaje a las células durante un periodo de tiempo muy corto. Las membranas se despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas (proteínas, DNA,...) que se encuentran alrededor. Ventaja: se aplica a millones de células a la vez; se obtienen eficiencias de entrada de las moléculas del 100% de las células que sobreviven (centenares de miles a millones).

9 Transformación química
Competent Cells CSHL DNA Learning Center. Mandel & Higa (1970) CaCl2

10 Reacción de Transformación

11 Protocolo Empezamos con E. coli en caldo de LB
Centrifugar 4000 rpm por 10 minutos Decantar el medio, invertir el tubo por 1 minuto Resuspender el “pellet” en 1 ml de 0.1 M CaCl2 (en hielo) (Cl-/ Ca+2 / Hielo) Centrifugar por 10 minutos Decantar Repetir el paso 4

12 Protocolo (continuación)
Transferir 1.0 mL de las bacterias competentes a un tubo de ensayo. Añadir la reacción de ligación. Transferir los tubos a un baño de maría a 42°C por 90 segundos “Heat shock” Regresar los tubos al hielo por 2 minutos. Añadir 175 uL de LB, mezclar usando el “Vortex” Heat shock proteins- con el choque de T se activan genes de Hsproteins, Esta el DNA dentro - Heat Shock proteins facilitan la integracion del DNA exogeno al genoma bacterial

13 Protocolo (cont.) Transferir la mezcla de las células competentes + el DNA recombinante al LB soft agar, mezclar. Colocar el LB soft agar sobre una placa de LB agar y mezclar hasta que cubra la placa completa (doble capa) Esperar hasta que se endurezca, invertir la placa e incubarla a 37°C por 8-12 horas.

14 ¿Preguntas?