Aislamiento de plásmidos

Presentación del tema: "Aislamiento de plásmidos"— Transcripción de la presentación:

1 Aislamiento de plásmidos
FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL EQUIPO 2 DÍAZ DE LEÓN SÁNCHEZ PAMELA LÓPEZ ORDUÑA ERIK LUNA TORRES KEVIN MARTÍNEZ LÓPEZ GUSTAVO

2 Un plásmido es una molécula de ADN circular, extracromosómico, bicatenario, superenrrollado, que se replica de forma independiente del genoma y que puede ser propagado en una población.

3 Características de los plásmidos
Son pequeños 5, ,000 pb. Replicación independiente y rastreabilidad. Tienen un único origen de replicación. Suelen llevar sólo uno o pocos genes. Molécula de DNA circular. Pueden conferir ventajas selectivas al organismo que lo posee. Son transmisibles. Resistencia a antibióticos.

4 Técnicas de aislamiento y purificación de plásmidos
Permiten obtener preparaciones de cantidad y calidad adecuadas que son la base de la mayoría de los protocolos en biología molecular. La mayoría toma en cuenta las diferencias topológicas entre los plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, y el tamaño de ambos.

5 Uno de los métodos más utilizados es el de desnaturalización alcalina en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Puentes de hidrógeno de cadenas complementarias de DNA se rompen y las cadenas permanecen cercanas entre sí. Cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente, la fidelidad de la reasociación es diferente para ambas macromoléculas.

6 La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a que las cadenas están próximas.
Las moléculas lineales de DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensión por centrifugación. El plásmido permanece en la solución y puede ser precipitado con alcohol después de que el DNA cromosomal ha sido removido.

7 Aislamiento de Plásmidos
Se han desarrollado un gran número de métodos para la purificación de DNA plasmídico de bacterias y todos ellos implican invariablemente tres pasos: Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora en medio de cultivo Recogida y lisis de las bacterias Purificación del DNA plasmídico

8 Objetivos Realizar el aislamiento de DNA plasmídico.
Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación de DNA genómico.

9 Reactivos 5mL de medio Luria-Kanamicina (30μg/mL)
Solución GTE: 50mM glucosa, 25mM Tris/HCl pH=8.0 y EDTA 10mM pH=8.0 Solución de lisis: 0.2N NaOH y 1% SDS p/v 3M Acetato de potasio pH=4.8 70% Etanol, Isopropanol 10 N NaOH 10% SDS

10 Protocolo de obtención de DNA plasmídico a partir de las células transformantes que se obtuvieron en la práctica anterior.

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12 Lisis celular con SDS/ NaOH
1.- Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Disuelve la membrana Se une a las proteínas y las desnaturaliza 2.- NaOH Desnaturaliza DNA (rompe los puentes de hidrógeno entre ambas cadenas)

13 Neutralización 2.- Acetato de potasio/ ácido acético
Neutraliza el NaOH (renaturalización de DNA plasmídico, se restablecen los puentes de hidrógeno). B) Convierte al SDS soluble a la forma insoluble PSD Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Dodecil Sulfato de Potasio (PDS)‏ (H2O sol. = 10%) (H2O sol. < 0.02%)‏

14 DNA plásmidico separado de los contaminantes por centrifugación       El sobrenadante contiene:          - El DNA del plásmido          - Los componentes celulares solubles           Pellet contiene:          - PDS          - Lípidos          - proteínas          - El DNA cromosómico

15 Referencias Sánchez Nieto, Sobeida. Manual de Prácticas de Bioquímica Experimental. Facultad de Química, Departamento de Bioquímica Básica. Semestre Mendoza DF Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular: Su Aplicación en Genética Básica. Editorial de Universidad del Rosario, Colombia, p 58-62 Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter Molecular Biology of the Cell. 5th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU