Ing. Nancy Paola Grajeda Nieto

Presentación del tema: "Ing. Nancy Paola Grajeda Nieto"— Transcripción de la presentación:

1 Ing. Nancy Paola Grajeda Nieto
Revisión de las metodologías para aislar e identificar campylobacter spp de los alimentos Ing. Nancy Paola Grajeda Nieto

2 Campylobacter coli Campylobacter jejuni

3 Introducción Campylobacteriosis es una enfermedad transmitida por los alimentos. Es la tercera enfermedad transmitida por alimentos 8% de casos globales. Vehículo de transmisión:29% % % otro. Menos de 1000celulas de campylobacter produce enfermedades en seres humanos (Negro et al 1988)

4 Objetivo

5 Los protocolos para el aislamiento de Campylobacter de los alimentos fueron adaptadas a microbiología clínica y metodologías para el aislamiento de Campylobacter de la leche se mantiene sin cambios, sin embargo los de ave de corral son objeto de investigaciones.

6 Aislamiento de Campylobacter de los alimentos

7 Condiciones de enriquecimiento para el aislamiento
Durante el aislamiento a partir de muestras, la presencia de otras bacterias presenta una limitación, por eso esta etapa es importante. Hay varios tipos de caldos para el enriquecimiento que se han desarrollado. (Corry et al 1995)

8 Desactivación del oxígeno
Existen varios agentes para la desactivación de oxigeno se han utilizado para los medios (agar y caldo) para el aislamiento, estos agentes pueden incluir sangre de caballo de otros animales o hematina alcalina sales de hierro, norepinefrina, sulfatos ferrosos, sodio metabisulfito, piruvato de sodio y carbón vegetal Oxyrase es una enzima selectiva que elimina el oxigeno de su entorno

9 PFGE DGGE PFGE En general es una técnica que permite la separación de fragmentos de DNA de alto peso molecular y tiene varias utilidades en el rastreo e investigación de los brotes de origen alimentario, también como la detección temprana de estos por el aumento de la incidencia de algunos subtipos usualmente indicados en brotes. DGGE electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización, también referida como electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente, es una técnica de huella, rastreo o trazado molecular (vulgarmente conocida en Inglés como molecular fingerprinting) usada en diversas disciplinas de la biología y la química, que consiste en la separación de cadenas de ADN de doble cadena dependiendo de su punto de desnaturalización, siendo dicha desnaturalización definida en éste caso como la separación de cadenas complementarias de ADN.

10 Condiciones micro aeróbicas en caldos de enriquecimiento.
Parece cuestión de tiempo para que las técnicas basadas en ADN para aclarar la diversidad de la población microbiana. Los géneros ya identificados principalmente son Pseudomonas y Acinetobacter, son bacterias que están mejor controladas durante el enriquecimiento bien adaptado

11 Revestimiento del medio

12 La mayoria de los medios de placa selectiva tienen varios agentes antimicrobianos, como cefoperazona y vancomicina como el principal inhibidor de la flora bacteriana. La incorporación de estos compuestos parecen ser una cuestión de costos, el uso de filtros mejorar el rendimiento de los medios que parecen tener una baja tasa de selectividad y aislamiento debido al crecimiento de microorganismo que compiten

13 Filtros de membrana Primera técnica de aislamiento
Principal ventaja es que los cultivos de Campylobacter puros se obtiene en h.

14 Identificación de Campylobacter
Pruebas de aglutinación en látex Uso de anticuerpos policlonales para detectar proteínas de la membranas de proteínas exteriores, las partículas de látex se recubren con inmunoglobulina y se enlazan contra el antígeno de Campylobacter.

15 Ensayo innumoenzimático (EIA)
La metodología EIA valora anticuerpos específicos según el antígeno que se emplee, produciéndose una reacción antígeno-anticuerpo. Al final de la reacción, se obtiene una solución de color que se mide con un espectrofotómetro, cuya intensidad está en relación directa con la cantidad de anticuerpos en la muestra.

16 métodos moleculares de identificación
Los métodos moleculares de identificación son rápidos y específicos para la identificación de Campylobacter spp. Además de la detección de segmentos específicos de ADN o ARN, protocolos de secuenciación están proporcionando una manera rápida para detectar segmentos específicos del ADN que son únicas para la identificación de la especie y en ocasiones nivel de subespecie

17 métodos basados en las características bioquímicas del microorganismo -método fenotípico- y en la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) -método molecular

18 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los ensayos de PCR multiplex (mPCR)
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento particular de éste es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores, primers o iniciadores  que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable.  Así se obtienen en cuestión de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN (Mullis, 1990).

19 Dada la reacción en cadena (PCR) se utiliza para la identificación de Campylobacter.
Los ensayos multiplex han sido diseñados para detectar la presencia de dos o mas especies en la misma muestra. Este protocolo de PCR fue capaz de detectar 100% de los 59 trenes de Campylobacter s examinados, que incluían 34 cepas de C. jejuni y 25 cepas de C. coli.

20 Actualmente el FSIS recomienda el uso de contraste de fase o aglutinación de látex.

21 Metodologías de detección actuales en los EE.UU.
USDA Servicio de Inspección de Seguridad Alimentaria (FSIS), Oficina de Ciencias de la Salud Pública (OPHS) metodología de detección / coli C. jejuni. La metodología sugerida por el FSIS se describe en el Laboratorio de Microbiología de Guía (MLG) ( Anónimo, 2013 a) El método de detección de Campylobacter actual de alimentos y agua se describe en el capítulo 7 del Manual Analítico Bacteriológico (BAM) ( Hunt et al., ).

22 Etapa pre enriquecimiento 25 g de matiz del alimento sospechoso
100 ml de caldo Bolton suplementado con sangre de caballo antibióticos 37°C , 4 h La temperatura de incubación 42°C a 44h Revestimiento CCDA

23 Se sacuden los matraces
Presuntas colonias son examinadas en el microscopio de contraste de fase Se sacuden los matraces Las colonias son confirmadas con las pruebas bioquímicas Muchas variantes se enumeran en función de la matriz alimentaria Ejemplo la leche cruda, tiene un paso de centrifugación Un ajuste pH y requiere filtración

24 Revisión de la Organización Internacional de Normalización (ISO)
En 2009 la Organización Internacional de Normalización (ISO) revisó Esta revisión describe numerosas nuevas actualizaciones en el protocolo para la detección y enumeración de Campylobacter de alimentos para los alimentos y los animales ( Anónimo, 200 6).Actualmente establece que hay enriquecimiento individual es óptima para la detección de Campylobacter en todos los alimentos y que la selectividad es mayor utilizando caldo de Preston. La versión revisada sugiere el uso de caldo de Bolton incubó micro aeróbicamente a h a 37 ° C y luego horas a 41.5 ° C en alimentos con bajo fondo o estresado organismos Campylobacter ( Anónimo, 2009)

25 La confirmación e identificación de las colonias sospechosas se determinara de la forma tradicional mediante pruebas bioquímicas y se utilizara el PCR

26 conclusiones Es posible encontrar a bacterias del genero Campylobácter en todas las especies de aves de corral, la infección de estas suele ser, a través de agua contaminada, alimentos y transmisión horizontal. En el ser humano, la transmisión indirecta es la más importante, debida a alimentos poco cocinados como son las aves (principalmente pollo), la leche y el agua. En muestras con bajo numero de células, se recomiendo el enriquecimiento durante 48 horas bajo condiciones aerobias para lograr un numero detectable de células La incubación de la muestra a 42 °C durante el proceso de aislamiento La confirmación de campylobacter según FSIS se basa en la microscopia de contraste de fase y prueba de fijación del látex Los medios mas recomendados son Bolton y agua de peptona y la CCDA

27 La carne de pollo contaminada requiere mayor tiempo de preparación
Aun no son aceptados por el ISO los ensayos de ADN son métodos sencillos y rápidos para confirmar Campylobacter he identificar el nivel de especie La carne de pollo contaminada requiere mayor tiempo de preparación Las pruebas de ADN pueden acoplarse a los métodos tradicionales , para mejor resultados