TEMA 2 PURIFICACIÓN DE ENZIMAS Introducción ¿Por que se purifican las enzimas? Objetivos y estrategias Reglas básicas para la selección de un proceso de.

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1 TEMA 2 PURIFICACIÓN DE ENZIMAS Introducción ¿Por que se purifican las enzimas? Objetivos y estrategias Reglas básicas para la selección de un proceso de purificación Evaluación de la purificación

2 ¿POR QUE SE PURIFICAN LAS ENZIMAS? - Conocer exactamente la reacción catalizada - Mecanismos de catálisis - Parámetros cinéticos - Regulación (alosterismo, modificaciones postraduccionales, etc) - Estudios estructurales (Rayos X, RMN, Dicroismo circular óptico) - Información escalado industrial Estudio aplicaciones (diagnostico, quimica ambiental, industria, etc)

3 OBJETIVOS EN LA PURIFICACIÓN 1.- MÁXIMA CANTIDAD POSIBLE Porcentaje de enzima purificada respecto a la cantidad original 2.- MÁXIMA ACTIVIDAD CATALÍTICA Enzima en condiciones operativas 3.- MÁXIMA PUREZA No contenga otras proteínas, esto condiciona el uso del enzima

4 EVALUACIÓN DE LA PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA GRADO DE PURIFICACIÓN Incremento de actividad específica respecto a la de partida RENDIMIENTO Porcentaje de enzima purificada Parámetros que se evalúan en la purificación Concentración de proteínas Actividad enzimática

5 6006000010080Cromat Intercam. iónico 80000 100000 Actv. (und) 20040090Cromat. exclusión 10100001400Extracto celular Actividad específica Units/mg Total Prot (mg) Volum. (ml) Tabla de Purificación Grado de purificación 20 60 1 Rendimiento -

6 UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Unidad internacional de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol de sustrato por minuto en condiciones estándar Katal, cantidad de enzima que consume un mol de sustrato por segundo 1 kcat = 60 10 6 UI ACTIVIDAD ESPECÍFICA Es el resultado de dividir la actividad en UI por la cantidad de proteína presente en la fracción Pureza

7 REGLAS BÁSICAS PARA LA SELECCIÓN DE UN PROCESO DE PURIFICACIÓN 1. Elige procesos de separación basados en las diferentes propiedades fisico-químicas 2. Elige condiciones que exploten las mayores diferencias posibles entre las propiedades de la enzima a purificar y las proteínas contaminantes 3. En el primer paso separa las mayor parte de las proteínas contaminantes 4. Usa un paso muy selectivo tan pronto como sea posible 5. El último paso se reserva para la tecnología mas costosa

8 Fuente Separación Purificación es un procedimiento secuencial Hay actividad? Desechar No Combinar Fracciones SI Control de pureza Ensayo de la cantidad de proteínas Ensayo de la actividad enzimática Pura? Estudios enzimáticos/estructurales, etc SI No Repetir con otra tecnica de separación Preparación Técnica de separación

9 FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN Agentes quelantes Rarocualquiera Metales pesados Separación del inhibidor Raro Plantas y bacterias Inhibidores específicos Concentración rápida Bastante común cualquiera Dilución proteína Agentes reductores comúncualquieraoxidación Bastante común Plantas y hongos Productos oxidación de fenoles Inhibidores de proteasas o frío ComúnmayoríaProteasa CalentamientorarocualquieraFrio EnfriamientouniversalcualquieraCalor Modo de contrarrestarlo frecuencia Fuente de enzima Factor inactivante

10 FUENTES DE ENZIMAS 1.ABUNDANCIA DE LA ENZIMA Fuentes mucha riqueza enzimática Ej Acetil-CoA carbosilasa Glándulas mamarias Fosfatasa alcalina Riñón E. Coli Manipula genéticamente/(ambientalmente) 2. POSIBILIDAD DE OBTENCIÓN DE LA FUENTE Glándula pituitaria (buena fuente) NO fácil disponibilidad 3. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR Ubicación de la enzima muy importante para el diseño del sistema de purificación

11 Enzyme a a EC number b b Source Intra/extra -cellular c c Scale of production d d Industrial use Animal enzymes Catalase1.11.1.6LiverI -Food Chymotrypsin3.4.21.1PancreasE -Leather Lipase e e 3.1.1.3PancreasE -Food Rennet f f 3.4.23.4AbomasumsE+Cheese Trypsin3.4.21.4PancreasE-Leather Plant enzymes Actinidin3.4.22.14Kiwi fruitE-Food a-Amylase3.2.1.1Malted barleyE+++Brewing b-Amylase3.2.1.2Malted barleyE+++Brewing Bromelain3.4.22.4Pineapple latexE -Brewing b-Glucanase g g 3.2.1.6Malted barleyE ++Brewing Ficin3.4.22.3Fig latexE-Food Lipoxygenase1.13.11.12SoybeansI-Food Papain3.4.22.2Pawpaw latexE++Meat Bacterial enzymes a-Amylase3.2.1.1BacillusE+++Starch b-Amylase3.2.1.2BacillusE+Starch Asparaginase3.5.1.1Escherichia coliI-Health Glucose isomerase h h 5.3.1.5BacillusI++Fructose syrup Penicillin amidase3.5.1.11BacillusI-Pharmaceutical Protease i i 3.4.21.14BacillusE+++Detergent Pullulanase j j 3.2.1.41KlebsiellaE-Starch Fungal enzymes a-Amylase3.2.1.1AspergillusE++Baking Aminoacylase3.5.1.14AspergillusI-Pharmaceutical Glucoamylase k k 3.2.1.3AspergillusE+++Starch Catalase1.11.1.6AspergillusI-Food Cellulase3.2.1.4TrichodermaE-Waste Dextranase3.2.1.11PenicilliumE-Food Glucose oxidase1.1.3.4AspergillusI-Food Lactase l l 3.2.1.23AspergillusE-Dairy Lipase e e 3.1.1.3RhizopusE-Food Rennet m m 3.4.23.6Mucor mieheiE++Cheese Pectinase n n 3.2.1.15AspergillusE++Drinks Pectin lyase4.2.2.10AspergillusE-Drinks Protease m m 3.4.23.6AspergillusE+Baking Raffinase o o 3.2.1.22MortierellaI-Food Yeast enzymes Invertase p p 3.2.1.26SaccharomycesI/E -Confectionery Lactase l l 3.2.1.23KluyveromycesI/E-Dairy Lipase e e 3.1.1.3CandidaE-Food Raffinase o o 3.2.1.22SaccharomycesI-Food

12 Células, tejidos,etc Rúptura Pellet con células intactas, organulos, membranas y proteínas de membrana Sobrenadante con proteínas solubles OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ENZIMÁTICO Enzimas intracelulares es necesario la ruptura celular Células sin pared rígida (tejido de mamiferos) Fácil (Pistilo giratorio) Células de pared rígida (plantas, hongos, bacterias, etc). a) Desecación b) Cizalla líquida a presión. Prensa French, Fraccionador de Sorvall-Ribi, etc c) Cizalla líquida con abrasivos. Bolas de vidrio 0,1 mm bacterias, 0,5 mm levaduras d) Sonicación (bacterias) e) Enzimas Líticas Lisozima, quitinasas, glucanasas, etc. f) Tratamientos químicos Detergentes, solventes orgánicos (tolueno,acetona, etc) agentes caotrópicos (Urea, Guanidina, etc)

13 ELIMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Inclusión dependerá - De la cantidad de ácidos nucleicos - Del uso del enzima (uso terapéutico debe estar libre) Eliminación es conveniente _ Interacciona con la enzima (agrega) Viscosidad del medio (impide manipulación, en procesos de filtración, centrifugación, etc). METODO DE ELIMINACIÓN Adición de policationes Estreptomicina Proteína básica (protamina) Polietilamina (polímero catiónico) Enzimas (NUCLEASAS)

14 PROPIEDADES FISICO-QUÍMICAS UTILIZADAS PARA LA SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Característica Procedimientos Tamaño  Dialisis – ultrafiltración  Electroforesis en gel  Cromatografia de exclusión molecular  Ultracentrifugacion Solubilidad  Precipitación con Sales  “ Solventes organicos  ‘’ por pH Hidrofobicidad  C. De interaccion hidrofóbica Carga  Cromatografia de intercambio iónico  Electroforesis  Isoelectroenfoque Selectividad  Cromatografia de afinidad

15 Tamaño Diálisis ( membranas semipermeables)

16 Tamaño Ultrafiltracion Centrifugación en gradiente de densidad Gradientes continuos de sacarosa  tubo de centrifuga Los componentes de la mezcla se separan por: Peso Tamaño Densidad Forma

17 Coeficiente de sedimentación S = M (1-V  ) N f M: peso molecular V: Volumen espécifico  : densidad de la solución N : numero de avogadro F: coeficiente de fricción Las proteinas migran de forma proporcional a este coeficiente

18 Cromatografía de filtración Las columnas rellenas polimeros inertes Sephadex: polimeros de dextrano Sepharose: agarosa Superose: agarosa entrecruzada Sephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano Tamaño

19 . 1.La columna se equilibra con el buffer de corrido 2. Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna) 3. Elución. Exclusión molecular Separa mezclas de proteínas por tamaño

20 Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada proteína Vt se calcula de la fórmula  r 2 x h Kav =Ve-Vo / Vt-Vo Kav Log Mw

21 Tarea La enzima pepsina y grupo de marcadores fueron eluidos de una columna de sephadex. Los volumenes de elución junto con los marcadores moleculares son los siguientes. Determina el peso molecular de la pepsina ?127Pepsina 13000158Citocromo C 17000150Mioglobina 23000139Chimiotripsinogeno 45000121Ovoalbumina 66000 107Albúmina PESO MOLECULARVOLUMEN ELUCION ml Proteína

22 Solubilidad Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación Mantiene nativa a la proteina Redisolucion sin perdida de actividad Proteina composicion de aa  le otorga un  comportamiento La solubilidad de la proteína depende:  Interacción intraproteina  Interaccíon proteína-proteína  Interacción proteína- disolvente

23 Interacciones mencionadas dependen de: pH Fuerza iónica Disolvente Temperatura Solubilidad

24 Solubilidad-pH La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicos Cuando el valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero  pI Solubilidad es minina Ej:  contenido de aa ácidos  pI bajo (4-5)

25 Solubilidad-pH

26 Solubilidad-Fuerza iónica Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M) aumenta con la [ sales]  Salting in La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales]  Salting out La alta [sal] elimina la esfera de solvatación de la proteína Las proteínas en H 2 O tienden a formar COMPLEJOS electrostáticos  precipitan Al aumentar la [sales]  proteina se rodea de contraiones  más soluble por > interacción prot-solv Capturan el H 2 O y > interacción prot-prot.

27 Solubilidad-Disolventes Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL) Se usan en distintas proporciones Bajan el poder de solvatación de las soluciones acuosas

28 Solubilidad- Temperatura 0-40 o C >T > solubilidad. 40-50 o C aumenta la inestab y DESNATURALIZAN (  solubilidad)

29 Carga Carga y signo depende de las proteínas Cromatografía de intercambio iónico Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7 Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentan carga negativa neta. Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7 Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentancarga positiva neta.

30 + + + + + + + + + ------ - - - ---- - - - + + + + + + + + + - - - - - ---- ------ - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - - ------ - - - - - - - - - - - Proteínas adsorbidas al intercambiador iónico A baja concentración de sal, se desprenden las proteínas menos electronegativas A mayor concentración de sal se desprenden las proteínas más electronegativas Intercambio iónico

31 Soportes cromatográficos

32 ISOELECTROENFOQUE Carga

33

34 Hidrofobicidad Cromatografía de hidrofobicidad fracciona a las proteínas explotando los diferentes grados de hidrofobicidad superficial de las proteínas. Las muestras se cargan con una alta fuerza iónica La elución se produce con un gradiente de fuerza iónica negativa, se pueden incluir detergentes o sustancias orgánicas Tipo de resina, consiste en partes hidrofóbicas unidas a una matriz inerte Fenil-Sefarosa, octil sefarosa

35 Selectividad Cromatografía afinidad Método más poderoso y selectivo Ligando: Sustrato, Cofactor, Inhibidor, Anticuerpo, etc Elución: Bajando el pH, aumentando fuerza iónica, incluir ligando soluble, etc Problemas: No se puede anclar el ligando El anclaje produce un cambio conformacional Fuerza de unión debe ser media Inespecificidad

36 TEST JUZGAR EL ÉXITO DE UNA PURIFICACIÓN ENZIMÁTICA Test de pureza - Electroforesis en gel de acrilamida. 1D ó 2D Tinción? Plata, Comassie, Fluerescencia, etc - Isoelectroenfoque. -Espectrometria de masas Test de actividad

37 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Diseño de enzimas:  La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una proteína se sobreexprese.  Dirigir la proteína sintetizada de novo al periplasma de la célula.  Adición de colas de afinidad.

38 Tarea Después de la extracción y purificación de una enzima microbiana, esta es muy poco estable para su uso industrial. ¿Qué piensas que se puede hacer para aumentar la estabilidad?