ACTUALIZACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND

Presentación del tema: "ACTUALIZACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND"— Transcripción de la presentación:

1 ACTUALIZACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND
Javier Gonzálvez Aracil, MIR-2º año

2 ÍNDICE Introducción. Factor von Willebrand (FvW): genética, estructura y funciones. Clasificación de la enfermedad de von Willebrand(EvW) y clínica asociada. Diagnóstico. Tratamiento. Conclusiones.

3 INTRODUCCIÓN La EvW es el defecto hemorrágico hereditario más frecuente (1% de la población aprox.). Afecta a ambos sexos y se caracteriza por la presencia de episodios de sangrado mucocutáneo o tras traumatismos o cirugías. A menudo, los síntomas son leves, por lo que la mayoría de pacientes están sin diagnosticar. La EvW es ocasionada por una deficiencia cuantitativa o cualitativa de una proteína coagulante sanguínea denominada Factor von Willebrand (FvW), que posee un papel fundamental en la hemostasia primaria, actuando como mediador en la fase inicial de adhesión de la plaqueta a la pared vascular en los lugares lesionados y protege al FVIII de la degradación. El diagnóstico depende de pruebas de laboratorio que miden la concentración de FvW (FvW:Ag), la actividad del Factor (cofactor de la ristocetina y/o unión al colágeno) y la actividad del FVIII, clasificando la enfermedad en tres tipos básicos. La subclasificación depende de test adicionales como la determinación de multímeros o la agregación de plaquetas inducida por ristocetina (RIPA). El tratamiento de elección en la mayoría de los casos es la desmopresina (DDAVP). En los casos más graves se incluye terapia de reemplazamiento con concentrados de FvW derivados del plasma.

4 INTRODUCCIÓN En 1926 Erik von Willebrand (Finlandia) describió el primer paciente : una niña de 5 años que vivía en las Islas Aland, en el Golfo de Botnia y que padecía un trastorno hemorrágico severo. Después de analizar a los 65 miembros de su familia, concluyó que esta patología no había sido descrita Y recibió el nombre de “pseudohemofilia” por sus diferencias con esta enfermedad: sangrado mucocutáneo, herencia autosómica, prolongación del tiempo de hemorragia y estudios de coagulación normal. En los años 50, cuando el test para el factor VIII se desarrolló, se observó que estos pacientes tenían unos niveles disminuidos de FVIII y el sangrado mejoraba con la infusión de plasma, lo que sugirió que las alteraciones ocurrían en el plasma y que una proteína diferente del Factor VIII jugaba un papel primordial en la fisiopatología de EvW. Esta proteína es FvW y fue clonada en los 80. Ahora sabemos que FVIII y FvW son dos moléculas diferentes, codificadas en distintos genes, y que el factor VIII se une al FvW formando un complejo no covalente que prolonga su supervivencia.

5 FACTOR VON WILLEBRAND (FVW): GENÉTICA, ESTRUCTURA Y FUNCIONES

6 FvW: GENÉTICA, ESTRUCTURA Y FUNCIONES
El gen del FvW se encuentra en 12p13.3. El RNAm codificado tiene una longitud de 9kb y la molécula traducida es un pre-pro-FvW que contiene aa, consta de un péptido señal de 22 aa, un propolipéptido (FvWpp) de 741 aa y una subunidad madura secretora de aa que es la que posee todos los puntos de unión para la función hemostática del FvW. Se han descrito más de 140 polimorfismos. Existe un pseudogén parcial no funcionante en el cromosoma 22 que duplica la secuencia del gen del FvW para los exones 23 al 34, con una homología del 97%. Este segmento del gen codifica dominios A1 A2 y A3.

7 FvW: GENÉTICA, ESTRUCTURA Y FUNCIONES
El FvW se sintetiza en las células endoteliales vasculares y en los megacariocitos de la médula ósea, como una subunidad proteica, que se ensambla a partir de subunidades idénticas en cadenas lineales de tamaño variable denominadas multímeros. El FvWpp es un monómero compuesto de 4 dominios (A-D) distribuidos de la siguiente manera: NH2-D1-D2-D´-D3-A1-A2-AA3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK-COOH

8 FvW: GENÉTICA, ESTRUCTURA Y FUNCIONES
El FvW que se libera a la circulación de forma aguda se acompaña de un aumento paralelo en FVIII. Circula como una larga proteína con un peso molecular la entre 500 y kD, dependiendo del grado de multimerización. Tras la secreción los multímeros del FvW de alto peso molecular (MAPM) experimentan una proteólisis parcial mediada por la proteasa plasmática ADAMTS-13, fragmentándose en el dominio A2 de la proteína del FvW . El FvW plasmático deriva casi en exclusiva de las células endoteliales y aumenta su síntesis y secreción en respuesta aguda a lesiones vasculares, inflamación, infección, neoplasia, embarazo e hipertiroidismo, promoviendo la hemostasia.

9 FvW: GENÉTICA, ESTRUCTURA Y FUNCIONES
El FvW es una proteína multifuncional adherente que posee 4 funciones en la hemostasia: El FvW se adhiere a las proteínas de la matriz subendotelial (p. ej., el colágeno), expuestas durante la lesión vascular Se fija a las plaquetas circulantes para iniciar la adhesión de las plaquetas a través del receptor glucoproteico plaquetario (GPIb). Tras la adherencia, la activación plaquetaria ocasiona la exposición del receptor GPIIb/IIIa a través del cual el FvW y el fibrinógeno median la agregación Es la proteína transportadora del cofactor de la coagulación, el FVIII.

10 FvW: GENÉTICA, ESTRUCTURA Y FUNCIONES

11 CLASIFICACIÓN DE LA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND(EVW) Y CLÍNICA ASOCIADA

12 CLASIFICACIÓN

13 CLASIFICACIÓN La EvW tipo 1 se caracteriza por una deficiencia cuantitativa parcial del FvW. Este es el más frecuente (70-80%). El tipo 2 de EvW, es un defecto cualitativo debido a la síntesis de una molécula anormal de FvW (20-25%), se distinguen 4 subtipos: En el tipo 2A existe una síntesis anormal o bien un incremento de la proteolisis de los multímeros del FvW, que son los más efectivos a nivel hemostático. Se caracteriza por una desproporción entre la actividad del FvW con respecto al FvW antigénico. El tipo 2B se caracteriza por una mutación con “ganancia de función” de la unión a la GPIb, produciéndose una unión espontánea de las plaquetas y, por tanto, un rápido aclaramiento de las plaquetas y de los MAPM. Se produce trombocitopenia. En el tipo 2M se produce una mutación por “pérdida de función” en la unión a la GPIb, que da lugar a una reducción de la unión del FvW a las plaquetas; el patrón multimérico es normal en pacientes con el subtipo 2M. La EvW tipo 2N (Normandy) se produce por una reducción de la unión del FvW al FVIII. Niveles normales de FvW pero niveles disminuidos de FVIII, lo que simula una hemofilia A leve o moderada. El tipo 3 es la forma más severa de EvW y se define por niveles indetectables de FvW (<5%) y una intensa disminución de FVIII.

14 CLÍNICA Varía de acuerdo con la gravedad de la deficiencia. Lo más común en la EvW es una tendencia a la hemorragia leve a moderada con hematomas, epistaxis, sangrado prolongado por heridas menores, menorragia y un excesivo sangrado tras trauma o cirugía, aunque a menudo no compromete la vida. Generalmente, los pacientes se presentan en la segunda o tercera década de la vida con sangrado prolongado. Los afectados por el tipo 3 tienen una tendencia a la hemorragia que se asemeja a la hemofilia A severa, con hemartrosis, hemorragias musculares y hemorragias graves con compromiso vital después de un trauma o cirugía, así como una elevada propensión a la hemorragia en pequeños vasos, que le diferencia de la hemofilia A. Síntomas leves de sangrado, similares a los de la EvW leve, son muy comunes y por lo tanto no son específicos para descartar la presencia de esta patología.

15 DIAGNÓSTICO

16 DIAGNÓSTICO El laboratorio juega un papel primordial tanto en el cribado como en el diagnóstico y tratamiento de la EvW. Seguidamente se describen las diversas técnicas empleadas según el algoritmo.

17 DIAGNÓSTICO TTPA Mide el tiempo que tarda en coagular un plasma después de la activación de los factores de contacto e indica la eficiencia de la vía intrínseca y la vía común de la coagulación. El TTPA está alargado si existe una deficiencia de factores de la vía intrínseca (XII, XI, IX y VIII) y también en las alteraciones de la vía común (X, V y I), aunque en este último caso, también se encuentra alargado el tiempo de protrombina (TP). NO es un test diagnóstico para la EvW y está prolongado en pacientes con EvW SÓLO si los niveles de FVIII están disminuidos,

18 DIAGNÓSTICO Tiempo de obturación/PFA®-100
Es el tiempo requerido para que las plaquetas ocluyan un agujero en una membrana impregnada con colágeno/epinefrina o colágeno/ADP (inductores plaquetarios). El sistema simula las condiciones de alto flujo de la microvasculatura lo que permite evaluar la adhesión y la agregación plaquetaria.

19 DIAGNÓSTICO El analizador es de la casa Siemens y las muestras se llevan al HGUA

20 DIAGNÓSTICO RECUENTO DE PLAQUETAS
El recuento de plaquetas es un test primario utilizado para la exclusión de enfermedades de la hemostasia primaria e identifica la EvW tipo 2B y la pseudoEvW tipo plaquetaria, que presentan trombopenias moderadas.

21 DIAGNÓSTICO Actividad del FVIII coagulante(FVIII:C)
Es la medida en plasma del cofactor de la coagulación. Se realiza utilizando un instrumento que mide la capacidad del plasma problema de acortar el tiempo de coagulación con un reactivo deficiente únicamente en FVIII. Es importante en el diagnóstico de la hemofilia con lo que los esfuerzos para estandarizarlo han sido mayores que en otros ensayos. Es importante tener en cuenta que el FVIII es muy lábil. Las muestras también se envían al HGUA.

22 DIAGNÓSTICO Determinación del antígeno de FvW (FvW:Ag)
Es un inmunoensayo que mide la concentración de FvW en plasma. Crucial para distinguir entre la reducción y/o la disfunción del FvW. Se utilizan métodos automatizados, bien con partículas látex (LIA) o por ELISA. Los ELISA usan antisueros poli o monoclonales muy sensibles. Los métodos en látex son más rápidos y baratos, pero pueden estar interferidos por el factor reumatoide o la lipemia. El FvW:Ag está reducido en más del 80% de los pacientes con EvW. En las formas leves, podemos encontrar, en situaciones de estrés, valores normales o cercanos. También son normales las concentraciones de FvW:Ag en el tipo 2N o 2B de la EvW. Hay que tener en cuenta que los individuos con sangre del grupo 0 tienen niveles más bajos de FvW. Las muestras se envían también al HGUA.

23 DIAGNÓSTICO Actividad de cofactor de la ristocetina (FvW:RCo)
Es un ensayo funcional del FvW, que mide la capacidad de interacción del FvW con el complejo GPIb de las plaquetas en presencia de ristocetina, un antibiótico que favorece la unión de las plaquetas, dando lugar a agregados plaquetarios que son eliminados de la circulación. La medición de la aglutinación de plaquetas fijadas y lavadas es considerada la técnica Gold Standard, siendo el método de referencia la LTA (agregometría de transmisión de luz)

24 DIAGNÓSTICO Los ensayos manuales FvW:RCo, tienen una precisión y una inadecuada sensibilidad en muestras con menos de UI/ dL de FvW:RCo. Se han estudiado varios métodos para complementar y sustituir al test FvW:RCo-LTA.

25 DIAGNÓSTICO Agregación de plaquetas inducida por ristocetina (RIPA)
Difiere de la determinación de FvW:RCo porque requiere que FvW y plaquetas pertenezcan al paciente. Diferencia la EvW tipo 2B de las 2A y 2M. Las bajas concentraciones de ristocetina (< 0.5 mg/dL), no originan agregación en personas normales, pero sí en pacientes con EvW tipo 2B y en EvW plaquetar o pseudo von Willebrand,que se diferencia del tipo 2B por presentar el test de unión a plaquetas (FvW:PB) patológico. Capacidad de unión FvW al FVIII (FvW:FVIIIB) Discrimina entre EvW tipo 2N y Hemofilia A leve o son portadores de esta última. Todos ellos van a presentar todos los estudios normales pero los pacientes con EvW tipo 2N tienen un defecto en el FvW que disminuye su afinidad por el FVIII. El análisis se lleva a cabo mediante la eliminación del FVIII endógeno unido y, a continuación, la adición de una concentración definida de FVIII recombinante exógeno; posteriormente se determina la cantidad de FVIII unida, mediante un ensayo de FVIII cromogénico. El nivel de FVIII se correlaciona entonces con la cantidad de FvW del paciente. Estas dos pruebas se realizan ya en una unidad especializada en Valencia.

26 DIAGNÓSTICO Determinación de la unión del FvW a las plaquetas: (FvW:PB) Mide la unión del FvW a plaquetas normales fijadas con paraformaldehido, a bajas concentraciones de ristocetina (0.3–0.6 mg/mL). La cantidad de FvW unido a las plaquetas fijadas se determina mediante anticuerpos marcados. Los individuos normales o con EvW diferentes al tipo 2 B, presentan una mínima unión de las plaquetas. Sin embargo, los pacientes con subtipo 2B, exhiben una unión significativa Tanto el subtipo 2B como el pseudoWillebrand, tienen aglutinación de plaquetas a bajas dosis de ristocetina, pero el test FvW:PB es capaz de diferenciar estas dos patologías: Solamente los pacientes con EvW tipo 2B tienen aumentado este test. El análisis también se realiza en Valencia Ratio FvW:RCo/FvW:Ag Puede ayudar al diagnóstico de los tipos 2A, 2B y 2M, diferenciándolos del 1. Un ratio FvW:RCo/FvW:Ag < indica alteración funcional del FvW. En el tipo 2A el ratio está disminuido, en el tipo 2B está descendido, pero puede ser normal y, en el tipo 2M, el ratio es inferior a 0.7.

27 DIAGNÓSTICO Análisis de los multímeros FvW
La estructura del FvW se evalúa por técnicas electroforéticas utilizando geles de agarosa (los multímeros son demasiado grandes para entrar en geles de poliacrilamida) El ensayo se clasifica en “baja resolución”, que diferencia los multímeros grandes de intermedios y pequeños, cada banda está separada en 2 subunidades y los geles de “alta resolución” que revelan la presencia de tres bandas, una principal con 2 sub-bandas. Permite la tipificación y subtipificación de la enfermedad de von Willebrand. El gel de baja resolución permite diferenciar las variantes 2 de los tipos 1 y 3 de EvW

28 DIAGNÓSTICO: NUEVAS PRUEBAS
Técnicas de unión a GPIbα Mide el FvW:RCo unido a una proteína recombinante GPIbα procedente de plaquetas estabilizadas nativas. El ELISA está recubierto con un anticuerpo anti-GPIbα. Después de la captura del GPIbα, se añade ristocetina. Los resultados obtenidos para todos los tipos de EvW en los ensayos GPIbα resultaron muy similares a la determinación FvW:RCo. La ventaja más importante de esta prueba es la posibilidad de medir actividades muy bajas de FvW. Se ha informado de un coeficiente de variación (CV) de 2.4% y un límite de detección de 3.5 UI/dL en las técnicas de aglutinación y un CV del 6-7% con un límite de inferior del rango de linealidadde 0.5 UI/dL para la quimioluminiscencia. Mediante el uso de un recombinante rGPIbα procedente de plaquetas con dos mutaciones con ganancia de función, se realizan determinaciones sin ristocetina, mediante la aglutinación de partículas, totalmente automatizada, con un rango de detección de UI/dL y un CV entre el 2-5%. Se han obtenido buenas correlaciones entre FvW:RCo y GPIb en muestras normales y patológicas incluyendo EvW tipo 2. Determinación propéptido de FvW (FvWpp) La determinación del FvWpp y el Ratio FvWpp/FvW:Ag se puede utilizar para detectar subtipos que presentan una disminución de la supervivencia del FvW. Un ratio alto se ha visto en pacientes con EvW tipo 1 Vicenza o un subgrupo de la EvW tipo 2A. Se determina por ELISA.

29 DIAGNÓSTICO MOLECULAR
El diagnóstico fenotípico en el laboratorio ES más accesible y menos costoso que el molecular. Puede ser útil para confirmar defectos en familias con EvW tipo 2A, 2B, 2M y 2N, donde las mutaciones se agrupan en lugares específicos del gen. 2 A: mutación sin sentido en el dominio A2. 2 B: mutación sin sentido en el dominio A1. 2 N: mutación sin sentido en el dominio de unión al FVIII. En la EvW tipo 3 no existen mutaciones específicas pero la existencia de grandes deleciones debe ser investigada, ya que pueden estar asociadas a aloanticuerpos contra el FvW. El patrón de mutaciones del tipo 1 es diferente al del tipo 3.

30 DIAGNÓSTICO: CONSIDERACIONES
Grupo sanguíneo: Los individuos de grupo 0 tienen unas concentraciones de FvW un 25% inferior al resto, por lo tanto los rangos de normalidad deben estar estratificados por grupo sanguíneo. Variabilidad de los niveles de FvW: Obliga a repetir estudios. El estrés, la toma de estrógenos o ACO pueden causar un aumento de los niveles de FvW.

31 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
Pseudo Von Willebrand o enfermedad de Von Willebrand tipo plaquetario Alteraciones muy similares a la EvW tipo 2B, donde el defecto está en las plaquetas y no en el plasma. Estos pacientes tienen niveles reducidos de FvW:Ag y plaquetas, con aumento de la respuesta a niveles bajos de ristocetina. Cuando se mezcla con FvW norma lse produce agregación espontánea de las plaquetas irreversible a diferencia de lo que ocurre en EvW tipo 2B. El tratamiento se basa en transfusión de plaquetas, desmopresina y crioprecipitados. Esta patología puede diferenciarse de la EvW tipo 2B, por el test FvW:PB o el análisis molecular (alteración en el cromosoma 17). Síndrome Von Willebrand adquirido En determinadas circunstancias, los pacientes pueden presentar una deficiencia de la función del FvW no hereditaria. La más frecuente es en paraproteinemias pero también en síndromes mieloproliferativos o hipotiroidismo. La estenosis aórtica severa puede causar suficiente daño en el flujo sanguíneo para originar una enfermedad de von Willebrand adquirida que mejora tras el reemplazamiento de la válvula. El tratamiento de la causa subyacente mejorará el síndrome. Si se precisa tratamiento urgente por hemorragia, se realizará tratamiento sustitutivo. Se diferencia de la EvW clásica porque los pacientes no presentan historia familiar y por su patología asociada. Hemofilia A La hemofilia A es una patología hereditaria ligada al cromosoma X, causada por la deficiencia o ausencia de FVIII. Según la actividad coagulante de FVIII, la hemofilia puede clasificarse en grave (<1%), moderada (1-4%) y leve (>5%), la clínica hemorrágica suele aparecer en los primeros meses de vida y la presentación más típica es la hemorragia articular (hemartrosis), siendo también frecuentes los hematomas y hemorragias profundas. Como hallazgos de laboratorio encontramos un déficit de FVIII aislado, con FvW y multímeros sin alteraciones .La EvW tipo 2N presenta muchas similitudes con la hemofilia A leve o moderada, pero la herencia, el tipo de sangrado, el FvW:FVIIIB y el estudio molecular los diferencian.

32 TRATAMIENTO

33 TRATAMIENTO El objetivo es restaurar los niveles de FvW: Ag y su actividad. Antifibrinolíticos: indicados en extracciones dentarias. Efectivos en el control de la epistaxis, gingivorragias y metrorragias. Desmopresina(DDAVP): via i.v., s.c. o intranasal. Limitación principal, la pérdida de eficacia con el tiempo. El test de desmopresina se utiliza como prueba diagnóstica y terapéutica (los pacientes tipo 1 responden, el resto, no). Se considera que responde cuando se produce un aumento del FVIII 2-3 veces por encima del nivel basal a la hora y mantiene un nivel superior a 30 UI/dL a las 4 horas. En cirugía menor o sangrados leves, suele ser suficiente con el tratamiento de desmopresina, mientras que en cirugía mayor necesitará terapia sustitutiva. Los pacientes tipo 2 A responden bien, los tipo 2M, no y está contraindicada en los tipo 2B(trombopenia). En el 2N el incremento de FVIII solo dura 3 horas. Terapia sustitutiva: concentrados de FVIII con mezcla de FVIII y FvW, cuyos niveles descienden al 50% en 12 horas. En formas graves se emplea FvW recombinante.

34 CONCLUSIONES

35 CONCLUSIONES La EvW es el trastorno hereditario de la coagulación más común en todo el mundo, afecta hasta al 0,5-1% de la población. Está causada por defectos o por niveles reducidos de FvW. Éste juega un papel importante en la hemostasia primaria, facilitando la adhesión de las plaquetas al endotelio Además el FvW es la proteína transportadora del factor VIII.

36 CONCLUSIONES La clínica es poco específica: episodios de sangrado, que van desde las encías (gingivorragias), epistaxis y menorragias, a la hemorragia intestinal. Los pacientes con EvW grave también pueden presentar hemartros. El diagnóstico de laboratorio de EvW se basa en 3 niveles: Técnicas de cribado (TTPA, recuento y PFA) Técnicas rutinarias (FVIII:C, FvW:Ag y FvW:RCo) Técnicas discriminatorias (RIPA, FvW:FVIIIB, ratio FvW:RCo/FvW:Ag Y análisis multimérico)

37 CONCLUSIONES Las pruebas genéticas sólo se realizan en caso de dudas en el tipo 2 de EvW. La prueba de DDAVP diferencia el tipo de EvW y sirve para elegir el tratamiento. El tratamiento se basa en DDVAP si responde o bien sustitutivo de FvW y FVIII.

38 CONCLUSIONES En nuestro laboratorio sólo se realizan las técnicas de cribado menos el PFA, que se realiza en el HGUA. Son técnicas inespecíficas. Las técnicas rutinarias se realizan en el HGUA y sí que son demandadas desde este hospital. El resto de técnicas se realizan en una unidad especializada desde Valencia, a donde son remitidos los pacientes. El servicio de hematología NO realiza el seguimiento de los pacientes afectos al tener la muestra una vida media de DOS horas.

39 MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN