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QFB Elizabeth Ernestina Godoy Lozano

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Presentación del tema: "QFB Elizabeth Ernestina Godoy Lozano"— Transcripción de la presentación:

1 QFB Elizabeth Ernestina Godoy Lozano
Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1) Defensa de Tesis QFB Elizabeth Ernestina Godoy Lozano Director: Dr. Daniel E. Noyola Cherpitel Asesores: Dr. Christian A. García Sepúlveda Dr. Flavio Martínez Morales

2 Infecciones Respiratorias Agudas
IRAS son causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. En México 3° causa de muerte en niños <5años Tasa de mortalidad 2005 18.8 por habitantes En niños menores de 5 años Tasa de mortalidad 2008 28.8 por habitantes Los principales virus que causan IRAS son: Rinovirus Virus de influenza A y B Parainfluenza 1-4 VSR hMPV

3 Genómica de influenza A
13,588 nt Segmento Nombre de la proteína Longitud (nt) 1 PB2 Subunidad 2 de la polimerasa 2341 2 PB1 Subunidad 1 de la polimerasa 3 PA Subunidad de la polimerasa 2233 4 HA Hemaglutinina 1778 5 NP Nucleoproteína 1565 6 NA Neuraminidasa 1413 7 M1 Proteína de Matriz 1027 M2 Proteína integral de membrana 8 NS1 Proteína no- estructural 1 890 NS2 Proteína no- estructural 2 Complejo Ribonucleoproteico Brown EG. Influenza virus genetics. Biomed & Pharmacother. 2000; 54:

4 Derivación antigénica Desplazamiento antigénico
Variación genética Drift Antigénico Derivación antigénica Shift Antigénico Desplazamiento antigénico Cambios genéticos puntuales que llevan a modificaciones antigénicas menores. Epidemias Cambios genéticos por rearreglo que llevan a modificaciones antigénicas mayores. 10-40 años Rearreglo entre virus de influenza humana y otras especies Pandemias

5 Influenza A (H1N1) pandémica
Marzo-abril 2009 Neumonías atípicas Adultos jóvenes Nueva variante de la influenza A 11 junio 2009 Nivel 6 Primera pandemia del Siglo XXI

6 Justificación Problema de salud pública
Infecciones respiratorias y del virus de influenza A Cambios y diferencias

7 Objetivo general Definir las características epidemiológicas, virológicas y genómicas de cepas de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1) responsables de pandemia en la ciudad de San Luis Potosí.

8 Objetivos particulares
Realizar un análisis epidemiológico de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1). Conocer las secuencias del genoma completo de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1). Realizar un análisis de polimorfismos de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1). Realizar un análisis filogenético de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).

9 Materiales y métodos

10 n=706 Muestras Sospecha de infección Extracción RNA viral
Hospital Central “Dr. Ignacio Morones Prieto” Laboratorio de Virología, departamento de Microbiología, UASLP. Exudado faríngeo, nasofaríngeo y lavado nasofaríngeo n=706 Extracción RNA viral High Pure Viral RNA kit; Roche Diagnostics Síntesis de cDNA Transcriptasa reversa Oligonucleótido UniFlu-RT Detección influenza A(H1N1) pandémica PCR anidada 8(NS) Amplicón 429pb Gómez-Gómez (2010)

11 Diseño de oligonucleótidos
Obtener secuencias “Influenza Virus Resource” NCBI Alineamiento Clustal W Robinson´s Alignment Reformatting Hairpins, homodímeros, heterodímeros y específicidad

12 Oligonucleótidos de amplificación genómica completa
Segmento Nombre Secuencia 5’→3’ Tamaño amplicón (bp) Tm (°C) Referencia 1 (PB2) SwPB2-F ATGGAGAGAATAAAAGAAC 2279 58 (Garcia-Sepulveda, 2009) SwPB2-R TAATTGATGGCCATCC 2 (PB1) SwPB1-F ATGGATGTCAATCCGA 2273 56 SwPB1-R TATTTTTGCCGTCTGAG 3 (PA) SwPA-F ATGGAAGACTTTGTGC 2151 59 SwPA-R CTACTTCAGTGCATGTG 4 (HA) SwHA-F ATGAAGGCAATACTAGTAG 1696 SwHA-R CATATTCTACACTGTAGAGAC 5 (NP) SwNP-F ATGGCGTCTCAAGG 1496 SwNP-R TCAACTGTCATACTCCTC 6 (NA) SwNA-F ATGAATCCAAACCAAAAG 1409 SwNA-R TTACTTGTCAATGGTAAATG 7 (M) SwMP-F TAACCGAGGTCGAAA 970 SwMP-R TACTCTAGCTCTATGTTGA 8 (NS) SwNS-F ATGGACTCCAACACC 890 SwNS-R TTAAATAAGCTGAAACGAG

13 Oligonucleótidos para secuenciación genómica
1 1746 Frg 1 Frg 2 Frg 3 Frg 4 pb 115 pb 83 pb 122 pb 61 pb 55 pb 4(HA)

14 Segmento Nombre Secuencia 5’→3’ Tamaño amplicón (bp) Referencia
1 (PB2) SwPB2-F1 AAAGAACTGAGAGATCTA 504 (Godoy-Lozano, 2009) SwPB2-R1 CCACTTCATTTGGGAA SwPB2-F2 AGGTTGAAACATGGTACC 740 SwPB2-R2 GCTCTTCTCCCAACCA SwPB2-F3 GCTAACGGGCAACCT 889 SwPB2-R3 CACATTCACAGTCAATGAGG SwPB2-F4 CCTAAGGCAACCAGAAGC 491 SwPB2-R4 TGGCTGTCAGTAAGTATGCTAG 2 (PB1) SwPB1-F1 ATGGATGTCAATCCGACTC 616 SwPB1-R1 CTATTGTTCTTTGCGTGACC SwPB1-F2 AGGAAGGCTAATAGATTTCTTA 639 SwPB1-R2 AGCATTTCTGCTGGTAT SwPB1-F3 GAGTGGTTCAGAAACATC 738 SwPB1-R3 TAACTCAAATGATCTTCTCGT SwPB1-F4 CAGATGGCTCTTCAATTGT SwPB1-R4 TTTTTGCCGTCTGAGTTC 3 (PA) SwPA-F1 GGAAGACTTTGTGCGAC 703 SwPA-R1 TCCATCTACATAGGCTCTAAA SwPA-F2 CAGTAGGAGTCTATGGGAT 607 SwPA-R2 TTTGCAGTCATCAAAGTCTA SwPA-F3 TTGGAAGCAGGTGCT 700 SwPA-R3 GGTTCCATTGGTTCTCAC SwPA-F4 TGATGTGGTGAACTTTGTAAG 600 SwPA-R4 AGTGCATGTGTGAGGA 4 (HA) SwHA-F1 CCGCAAATGCAGACACAT 510 SwHA-R1 TTAATGTAGGATTTGCTGA SwHA-F2 GGCCCAATCATGACTCGA 501 SwHA-R2 AGGCTGGTGTTTATAGCACC SwHA-F3 CCGAGATATGCATTCGC 636 SwHA-R3 CGTTTCCAATTTCCTTGGC SwHA-F4 TTGATGATGGTTTCCT 387 SwHA-R4 TTAGAGCACATCCAGAAA

15 Amplificación genómica
PCR anidada Taq:Pfu Secuenciación Programa de Termociclaje Primera y segunda PCR °C Tiempo Ciclos 95 5 min 1 20 seg 35 Tm 30 seg 72 90 seg 4

16 Secuenciación genómica
Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad del CINVESTAV-Irapuato Electroferogramas 4peaks

17 Mutaciones asociadas a la resistencia a fármacos
Zanamivir D-151 N, G, E o V Oseltamivir H274Y y E119V Neuraminidasa

18 Análisis bioinformático
Homología BLAST dN/dS “Codon-based Z-test of selection” “Position-wise based selection estimation (HyPhy)” MEGA 5 Recombinación y similaridad SimPlot versión 3.5.1 Modelo evolutivo FindModel Inferencia del ancestro común más reciente BEAST v1.5.4, Tracer v1.5 TreeeAnnotator v1.5.4, FigTree v1.3.1

19 Resultados y discusión

20 Epidemiología 1° marzo 2009- 9 abril 2010 706 muestras
133 (18.8%) positivas 17 muestras

21 Secuencias generadas 2 genomas completos 7 parciales 8 parciales
Segmento No. 1(PB2) 11 2(PB1) 3(PA) 4(HA) 9 5(NP) 6(NA) 10 7(M) 8(NS) 7 2 genomas completos 7 parciales 8(NS) 8 parciales Mas de 1 segmento Superposición para generar secuencia completa Sin ambigüedad 99% similitud

22 Selección purificadora
dN/dS Hipótesis de neutralidad dN/dS=0 Hipótesis de selección purificadora dN<dS Hipótesis de selección positiva dN>dS Proteína Valor p Hipótesis PB2 0.001 Selección purificadora PB1 PA 0.004 HA 0.0004 NP 0.0001 NA 0.04 M1 0.008 M2 0.162 NS1 0.341 NS2 0.148

23 Cepas circulantes en una misma temporada son muy parecidas.
El virus tiende a la conservación después de venir de una serie de cambios que provocaron que el virus saltara de hospedero a hospedero. dN/dS  Selección purificante Un año de circulación.

24 Análisis de similitud Secuencias consenso por hospedero Locales
Porcino Humano Aviar

25 Análisis de similitud Secuencias consenso por subtipo Locales H1 H2 H5

26 Análisis de similitud Secuencias consenso por región geográfica
Locales Norte América Asia Europa

27 Análisis de Bootscan Secuencias consenso por región geográfica
Norte América Europa Asia

28 Origen geográfico Segmento Hospedero Origen geográfico 1(PB2) porcinos
Asia 2(PB1) humanos Oceanía 3(PA) aves Norte América 4(HA) 5(NP) 6(NA) Europa 7(MP) 8(NS)

29 Fraser C. Pandemic Potencial of a Strain of Influenza A (H1N1): Early Findings. Sciencexpress. 11 Mayo 2009.

30 Eventos de recombinación
Segmento Recombinación Similitud Similitud de secuencia restante 1(PB2) porcinos Asia porcinos Norte América 3(PA) 1-277 aves Europa aves Oceanía aves Norte América 4(HA) 1-300 porcinos Europa 6(NA) 1-253 aves Sudamérica 7(MP) aves Europa aves Asia

31 Mutaciones puntuales He et al., 2009 Recombinación
Diversidad mayor en virus de la influenza aviar.

32 Nosotros encontramos:
No existe ningún otro reporte que documente recombinación entre cepas de influenza. Nosotros encontramos: Recombinación de cepas de distintas regiones. Virus de influenza humana. Estos datos indican que además de la derivación y desplazamiento antigénico la diversidad genética de influenza también puede generarse por recombinación. Se desconoce el impacto de este mecanismo en la generación de nuevas variantes de influenza.

33 Ancestro común más reciente
6(NA) 1(PB2) 4(HA) 7(M2) 8(NS1) 3(PA) 7(M1) 8(NS1) 2(PB1) 5(NP) JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE FEB MAR

34 Ancestro común más reciente
Segmento Smith (2009) Godoy (2010) 1(PB2) 9 SEP 2008 11 ene 2009 2(PB1) 24 OCT 2008 16 dic 2008 3(PA) 7 OCT 2008 2 nov 2008 4(HA) 28 AGO 2008 30 ene 2009 5(NP) 27 MAR 2008 20 dic 2008 6(NA) 8 AGO 2008 19 oct 2008 7(M1) 3 AGO 2008 8 JUL 2008 7(M2) 16 mar 2009 8(NS1) 21 MAY 2008 21 feb 2009 8(NS2) 22 mar 2009

35 El MRCA estima la fecha más probable en que el ancestro putativo comenzó a circular.
A medida que más información se compara, la estimación se vuelve más refinada. Nuestro estudio incluye solamente secuencias mexicanas. Periodo de estudio: 30 marzo abril 2010

36 Tasas de mutación global
Segmento Tasa de mutación x 10-3(s/s/a) § 1(PB2) 6.32 2(PB1) 5.31 3(PA) 4.22 4(HA) 17.6 5(NP) 6.53 6(NA) 6.30 7(M1) 5.09 7(M2) 49.5 8(NS1) 17.7 8(NS2) 58.5 § Substituciones nucleotídicas por sitio por año.

37 Mutación por posición codónica
PA NS1

38 Tasa de mutación Es mayor a lo anteriormente reportado.
El virus está evolucionando rápidamente. Etapas tempranas de la evolución del virus hay una gran diversidad. Posteriormente predomina la cepa biológicamente más exitosa.

39 Resistencia a antivirales
No se encontraron las mutaciones Zanamivir 151 Oseltamivir  119 y 274 Presión selectiva Harvala (2010) Cepas resistentes a oseltamivir OMS 11 agosto 2010 120 cepas resistentes a oseltamivir

40 Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad
5(NP) 445

41 Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad
437

42 Proceso evolutivo Perpetuarse. Al principio de la pandemia se originó un número elevado de experimentos biológicos destinados a generar mucha diversidad con la posibilidad de que alguna de las cepas lograra colonizar a un hospedero y convertirse en una cepa biológicamente exitosa.

43 Conclusión MRCA es más reciente. La tasa de mutación global es mayor.
No se encontraron mutaciones que confieren resistencia a antivirales. La recombinación de segmentos del virus de la influenza entre cepas circulantes en diversas regiones y hospederos es una posible manera en la que se puede explicar la diversidad de estos virus.

44 Actividades realizadas durante la maestría
Febrero SLP,SLP Curso sobre Infecciones Virales: Epidemiología, diagnóstico molecular y aplicación clínica Junio SLP,SLP Curso sobre la Tecnología del ADN Recombinante: Producción y purificación de Taq ADN polimerasa Septiembre 2009 SLP,SLP Asistente a la I Reunión Académica de Enfermedades infecciosas y su prevención y a la 8ª Reunión Internacional de vacunas Octubre 2009 Guadalajara, Jalisco Asistente al XXXIV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica Octubre SLP, SLP Participación como ponente durante la 16ª Semana de Ciencia y Tecnología

45 Noviembre 2009 Merida, Yucatán
Asistente al VI Congreso Nacional de Virología Mayo 2010 Guadalajara, Jalisco Cartel XXXV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica “Hospitalización asociada a infección por virus de influenza pandémica A(H1N1) 2009 e influenza estacional en pacientes menores de 5 años”. Godoy-Lozano; Contreras-Treviño; Aranda-Romo; Lovato-Salas; Matienzo-Serment; Hernández-Salinas; Barrios-Compeán; Ochoa-Pérez; García-Sepúlveda; Noyola-Cherpitel. Facultad de Medicina. UASLP. SLP,SLP. Aportaciones a GenBank GU811749, GU811750, GU811751, GU811752, GU811753, GU811754, GU811755, GU811756, GU811757, GU

46 Manuscritos Pandemic influenza A(H1N1) 2009 and respiratory syncytial virus associated hospitalizations. Lovato-Salas; Matienzo-Serment; Monjarás-Ávila, Godoy-Lozano, Comas-García; Aguilera-Barragán; Durham-González; Contreras-Vidales; Ochoa-Pérez; Gómez-Gómez; García-Sepúlveda; Noyola . En revisión en Journal of Infection. Viral DNA Extractions from Blood Using Laudry Detergent. Guerra-Palomares; Godoy-Lozano; Noyola; García- Sepúlveda. En revisión en Nucleid Acid Research.

47 Agradecimientos CONACYT Asesores Laboratorio de Virología Familia
Amigos

48 Gracias


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