Vacunas recombinantes

Presentación del tema: "Vacunas recombinantes"— Transcripción de la presentación:

1 Vacunas recombinantes

2 Introducción histórica

3 Historia de las vacunas
Entendemos por vacuna, sustancia generalmente fabricada a partir de microorganismos patógenos para el ser vivo, que al ser administrada produce defensas frente a la enfermedad que queremos prevenir. A lo largo de la historia se ha producido un gran avance en lo que a vacunas se refiere que nos ha permitido pasar de la primera vacuna rudimentaria contra la viruela a la vacunología reversa que está en vías de desarrollo y expansión en la actualidad.

4 Variolización Los primeros escritos relacionados con la vacunación (“el tratamiento correcto de la viruela”) se remontan al siglo XI en China, donde una monja budista realizó inoculación antivarólica a partir de enfermos que padecían viruela. Otros textos (“El espejo dorado de la medicina”) también sitúan en China hasta 4 formas diferentes de inoculación antivariólica.

5 Primera vacuna Edward Jenner (médico británico) inventó en 1796 la primera vacuna contra la viruela. El experimento consistió en inyectar a un niño de 8 años la vacuna procedente de una pústula del brazo de una ordeñadora (ésta había sido contagiada por una vaca) a través de dos cortes superficiales en el brazo, consiguiendo inmunizar al niño ante la viruela humana.

6 Vacunas de Pasteur Louis Pasteur realizó en 1881 una demostración pública de vacunación inoculando bacilos atenuados de ántrax para demostrar que se podían obtener vacunas a partir de cultivos de laboratorio; esto le permitió desarrollar la vacuna contra el cólera de las aves y el carbunco. En 1885 obtuvo la vacuna contra la rabia, que estaba compuesta de agentes debilitados productores de la enfermedad sacados de médula espinal de animales rabiosos.

7 Vacunas de principios del XX
El siguiente paso en la evolución fue la inactivación química de toxinas. En 1909 se desarrolló la vacuna contra la tuberculosis (cuestionada durante toda su historia). En 1935 se desarrolló la vacuna contra la fiebre amarilla. En 1936 se desarrolló la vacuna contra el virus influenza A y en 1938 contra la rickettsia.

8 Edad de oro de la vacunación
A partir del impulso del cultivo celular y la capacidad de desarrollar virus humanos fuera de un organismo vivo de manera bastante sencilla y segura, se produjo el boom en vacunología. Se obtuvieron en esta época vacunas contra poliomielitis (1954), sarampión, paratiroiditis, rubeola y varicela.

9 Vacunas en los 70 y 80 En estas décadas se introdujeron las vacunas formuladas con polisacáridos capsulares o proteínas purificadas, es decir las que se conocen como vacunas de subunidades. En esta época destaca la parición de la vacuna meningocócica, la vacuna neumocócica y la primera generación frente a haemophilus influenzae tipo B.

10 Vacunas finales del XX Avery y Goebel demostraron que la inmunogenicidad del polisacárido podría incrementarse si se uniese a una proteína transportadora, de esta idea surgen las vacunas conjugadas. La primera vacuna conjugada comercializada fue contra el haemophilus influenzae tipo B.

11 Presente y futuro de las vacunas
En 1986 gracias al uso de la ingeniería genética se formula la primera vacuna DNA recombinante frente a Hepatitis B. Actualmente existen diversas vacunas de este tipo en el mercado y en vías de desarrollo. En el futuro las expectativas están focalizadas en la vacunología reversa, es decir el hecho de que un ordenador sea capaz de elaborar la vacuna sin pipetas, ni mascarillas ni tubos de ensayo

12 Vacunas recombinantes

13 Características

14 Definición Vacunas obtenidas utilizando la tecnología del ADN recombinante en alguna etapa de la producción.

15 Bondades de una vacuna ideal
Precio competitivo. Inocuidad. Estabilidad física y genética. Posible inmunización simultánea contra múltiples componentes protectores de diversos patógenos. Protección de larga duración con 1 sola dosis VO. Inducción de inmunidad mucosal en máximo 2 semanas. Estimulación de respuesta inmune humoral y celular a nivel sistémico.

16 Proteómica de patógenos
La vacuna recombinante es un área multidisciplinaria Inmunología Biología de patógenos Nuevas vacunas Química Bioinformática Genómica de patógenos Proteómica de patógenos

17 Son un plásmido bacteriano diseñado para expresar un gen (o genes) de interés que codifiquen, por ejemplo, para una proteína inmunogénica de un patógeno determinado, contra la cual se desea inducir una respuesta inmune protectora en el individuo vacunado. Por tanto su acción imita lo que ocurre en una infección por patógeno completo).

18 Reúnen en un mismo producto biológico:
Eficacia de vacunas vivas convencionales. Seguridad de vacunas inactivadas convencionales.

19 Componentes básicos del vector que garantizan óptima expresión celular:
Origen de replicación procariótico para amplificación y propagación del plásmido en bacteria. Gen marcador de selección de las células bacterianas portadoras del plásmido. Promotor eucariótico fuerte que garantiza elevados niveles de transcripción del gen de interés en la célula eucariota. Sitio de múltiple clonaje justo después del promotor para insertar la secuencia de interés. Secuencia de terminación de la transcripción y secuencia estabilizadora del ARNm transcrito.

20 En el proceso de obtención de las vacunas recombinantes hemos de prestar especial atención a 3 características: Calidad. Seguridad. Eficacia.

21 Calidad Certificar que no se han experimentado ni cambios ni mutaciones. Descripción completa de las células, las bacterias o las variedades de virus y los plásmidos* con los que se comienza la “construcción” de la vacuna recombinante. *En caso de presentar indicios de inestabilidad serán rechazados.

22 Estrategia de construcción de los vectores según lo descrito en la directiva 2001/18/EC .
Caracterizar con métodos bioquímicos, inmunológicos y moleculares el antígeno expresado por la vacuna , para garantizar la calidad del producto obtenido.

23 Seguridad Ensayos que acrediten la seguridad de la vacuna en la misma especie animal que vaya a ser la destinataria del producto (Directiva 2001/82/EC -Annexo I, título II, Parte 7 -). Cerciorar que los animales vacunados no pueden trasmitir la enfermedad a los humanos o otros animales (si puede suceder, se especifica claramente en las condiciones de uso).

24 Acreditar que no son patogénicas o lo son en un nivel insuficiente para poner en peligro la seguridad del animal vacunado. Demostrar que la inserción de genes foráneos no provoca un aumento de la virulencia ni una modificación en el tropismo tisular.

25 Cumplir normativa comunitaria sobre ecotoxicidad (Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ):
Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en diferentes especies (tanto diana como no diana). Estudio de posible transmisión horizontal y recombinación potencial del vector vacunal o de parte de él. Estudio de especificidad de especie diana. Estudio de la posible instalación en el ambiente. Método validado para poder distinguir entre vacuna y microorganismo “salvaje”, especialmente en situaciones de planes de control y erradicación de la enfermedad. Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados con el mismo vector pero acompañado de otras secuencias.

26 Eficacia Estudiar el efecto de la inmunidad preexistente al vector y/o al antígeno. Documentar la inmunorespuesta post-vacunación y considerar impacto en planes de vacunación en vigor. En vacunas que contienen más de un antígeno, es necesario evaluar la respuesta a cada antígeno.

27 TIPOS

28 Podemos subdividirlas en 3 subtipos:
Vacunas que utilizan virus o bacterias como vectores. Vacunas de ADN desnudo. Vacunas comestibles.

29 VACUNAS QUE UTILIZAN VIRUS O BACTERIAS COMO VECTORES
Se incorpora un gen que codifica para una proteína inmunogénica en el genoma de un microorganismo atenuado que se denomina vector. El vector al replicarse en el organismo receptor, expresa los genes propios y el que produce la proteína incorporada. La proteina incorporada se presenta al sistema inmune en su superficie celular. Induce respuesta inmune humoral y celular.

30 Los vectores más usados son:
Virus de família poxviridae. Adenovirus. Herpevirus. Influenza. Bacterias como Salmonella, Streptococcus, Staphilococcus y E-coli.

31 Existen riesgos asociados:
La multiplicación viral es intracelular, por tanto una sola partícula en una sola célula puede dar lugar a millones de virus en poco tiempo. ADN viral puede integrarse en el genoma de los hospedadores de forma latente (esta integración puede tener consecuencias no deseables).

32 Posibilidad de recombinación genética entre virus MG y otro cercano que esté circulando en el receptor, que generaría genotipos y fenotipos alterados. Cambios menores en los virus pueden dar lugar a cambios drásticos en espectro de hospedador, permisividad y patogenidad. Características específicas de los nuevos virus introducidos en el ecosistema.

33 Vacunas de ADN desnudo Son plásmidos de DNA en los que se incorpora gen que expresa antígeno inmunógeno del patógeno e induce inmunidad contra él. Se expresan dentro de células del organismo receptor y se presentan al sistema inmune en combinación con antígenos celulares de clase I (igual que en infección natural).

34 Útiles particularmente en inducción de células T-citotóxicas, por tanto protegen más ampliamente ante diferentes cepas virales. Presentan el antígeno con modificaciones translacionales y conformacionales nativas, por tanto estimulan anticuerpos de óptima especificidad.

35 Existen riesgos asociados:
Integración potencial del plásmido en el genoma de las células hospedadoras. Inducción potencial de anticuerpos contra ADN del plásmido inyectado. Problema de conformación no nativa de proteinas bacterianas en vacunas con ADN inoculadas en animales.

36 Inducción potencial de autoinmunidad.
Liberación accidental de las construcciones de ADN desnudo pueden favorecer transferencia horizontal de genes. Tienden a la inestabilidad, por tanto posibilidad de generar nuevos virus.

37 Existen beneficios asociados:
Efectivas en modelos animales sin necesidad de adyuvantes o sistemas de administración. Solo expresan genes que inducen inmunidad. Las produce el mismo animal, siguiendo las instrucciones del gen insertado en el plásmido de expresión. Menor dependencia de la cadena de frío que las vacunas con proteínas.

38 Vacunas comestibles Se producen a partir de plantas modificadas genéticamente que actúan como bioreactores de antígenos de patógenos que inducen inmunidad. Administración tan segura como el simple hecho de comer una fruta.

39 Su producción puede resultar barata.
Son ideales contra patógenos que causan enfermedades respiratorias, urogenitales e intestinales, donde es básico sensibilizar el sistema inmunitario mucosal. Se evita el problema de degradación de proteínas inmunogénicas por temperatura

40 Existen riesgos asociados:
Posibilidad de intercambio genético entre la planta modificada genéticamente y especies silvestres asociadas. Actualmente la ingeniería genética controla con precisión las características que se quiere implementar en las plantas, pero no controla totalmente la localización de la inserción dentro del genoma de la planta hospedadora.

41 La mayoría de los intentos realizados para producir antígenos de patógenos animales en plantas, han resultado ser tóxicas para la planta. La cantidad del antígeno producido no es uniforme, por tanto la dosificación es difícil de controlar.

42 Mecanismo de acción

43 Estrategias de inmunización
Es ventajoso combinar 2 o más tipos de vacuna (se administra 1 o más dosis de la 1ª vacuna seguida de 1 o más dosis de la 2ª). Estrategia ideal :Inmunizar primero con vacuna de ADN y después administrar una vacuna de subunidades como recuerdo.

44 El resultado final de la respuesta inmune puede verse influido por:
Modo de administración. Dosis (número, tamaño y frecuencia). Adyuvantes.

45 Modo de administración
Múltiples rutas de inoculación: Intramuscular. Subcutánea. Intraperitoneal. Intradérmica. Intravenosa. Oral. Rectal. Vaginal. Intraorbital. Intratraqueal. Intranasal.

46 Administración vía inyección con aguja (parenteral) o vía métodos biolísticos con pistola de genes.
La pistola de genes garantiza una mayor eficiencia, porqué hace que ADN penetre al interior de la célula, además también representa un ahorro porqué se necesitan dosis hasta 100 veces menores. La administración parenteral es menos eficaz porqué se queda en medio intersticial (es decir desprotegida frente a nucleasas).

47 Dosis El número de dosis afecta la respuesta inmune (generalmente, se necesita > 1 inmunización para obtener respuesta lo suficientemente fuerte como para ser protectora). El intervalo entre las dosis resulta crítico (al aumentarlo aumenta la respuesta inmune conferida por la vacuna). La cantidad; depende de diferentes factores: Tamaño del individuo. Inmunogenicidad del antígeno utilizado. Eficiencia de transfección durante la administración.

48 Adyuvantes Selección en función del tipo de respuesta inmune que busquemos. Existen diferentes tipos: Adyuvantes químicos (hidróxido de aluminio). Adyuvantes genéticos (consisten en coinmunizar con un gen estimulatorio). Adyuvantes que potencian la inmunidad mucosal (toxina lábil de E.coli mutante, IL proinflamatorias,…)

49 El MECANISMO DE ACCIÓN se resume en :
Inmunización con un plásmido que contiene la información genética de uno o varios genes que codifican para proteínas inmunogénicas de determinado patógeno. El plásmido actúa como un vector permitiendo la expresión en el interior de las células que son transfectadas por la inmunización. La respuesta inmune generada (humoral o celular), ayuda a contrarrestar una infección con el patógeno, por tanto es una buena herramienta de profilaxis, sobre todo en las enfermedades (como las virales) que requieren ambas ramas de la respuesta inmune.

50 Mecanismos de presentación antigénica
Existen al menos tres que garantizan la inducción de una respuesta inmune: Estimulación directa mediada por células somáticas (miocitos, queratinocitos o cualquier célula MHC II negativa). Transfección directa de APC. Presentación cruzada (Cross-priming), donde el plásmido transfecta una célula somática y/o APC, y la proteína secretada es captada por otra APC donde es procesada para su presentación a linfocitos T CD8+ .

51 Mecanismos de respuesta inmune
Inmunidad HUMORAL frente a numerosas proteínas en diversas especies. La respuesta es menor que la obtenida con virus vivo a dosis subletales y el pico de anticuerpos es más tardío (no es desventaja, porqué al ser vacunas de ADN pueden generar respuesta de memoria).

52 Inmunidad CELULAR vía LT CD4+ cooperadores .
Si se administra vía IM, el carácter proinflamatorio de los motivos CpG no metilados del ADN bacteriano induce síntesis y excreción de IL-12 y por tanto una respuesta Th-1. Si se administra con pistola de genes, se genera una respuesta de tipo Th-2.

53 Inmunidad CELULAR vía LT CD8+ citotóxicos, es una de las principales ventajas de las vacunas de ADN porqué es difícil de inducir con las vacunas convencionales.

54 Inmunidad MUCOSAL, es decisiva en la protección contra los microorganismos invasores, ya que la mayoría de patógenos veterinarios se transmiten a través del epitelio de los tractos respiratorio, gastrointestinal y genital. Las estructuras linfoides asociadas a estas mucosas, tienen epitelio con células especializadas que transportan el antígeno intacto desde la membrana apical expuesta hasta la superficie basolateral donde el antígeno interactúa con la APC y se inicia la estimulación de la respuesta mediada por LT y LB.

55 Memoria inmunitaria Esta respuesta depende del tipo de antígeno empleado en la vacuna. Existen varias posibilidades para explicarla : El antígeno está presente continuamente a bajos niveles (suficientes para la presentación antigénica pero por debajo del límite de detección) o bien el ADN no se detecta pero el antígeno sintetizado pudiera persistir in vivo, proporcionando así un reservorio para mantener la respuesta inmune El plásmido y el antígeno sintetizado desaparecen y las respuestas observadas son antígeno-independientes. Las células memoria generadas por esta vacunación son cualitativamente diferentes de las inducidas por otros tipos de vacuna.

56 VACUNAS COMERCIALIZADAS

57 Vacuno (1997) Vacuna contra virus sincitial respiratorio bovino, a partir del gen que codifica para la proteína G del virus; se ha comprobado que la vacunación intradérmica sin aguja confiere mayor protección que la intramuscular o intradérmica con aguja. (1999)Vacunas contra IBR-1 (virus de rinotraqueitis infecciosa bovina 1), a partir del gen de la glicoproteína D del virus (con o sin región transmembrana) ; protege aunque en general el título de anticuerpos que se obtiene no es elevado (ni se incrementa con un aumento del número de dosis); además también protege a terneros recién nacidos con nivel detectables de anticuerpos calostrales. (1999) Vacuna contra BVDV (virus de la diarrea viral bovina), a partir de la proteína E2 del virus, clonada en un vector de ADN. Se ha demostrado que su administración por vía intramuscular en solución salina o en liposoma, induce respuesta de anticuerpos neutralizantes y respuestas linfoproliferativas específicas a este antígeno.

58 Porcino (1996) Vacuna contra la pseudorrabia, a partir del gen clonado de la glicoproteína D del virus, con la que se ha podido obtener grandes resultados en lechones de 1 día provenientes de madres no vacunadas y sin AC anti-virus de la pseudorrabia. (1997) Vacuna contra la pseudorrabia, a partir del gen de la glicoproteina C, con la que se ha podido conseguir protección en animales de más de 1 día. (2001) Vacuna contra virus de gastroenteritis transmisible, a partir del gen que codifica para la glicoproteína S, utilizando como vector el serotipo 5 de adenovirus (se obtiene respuesta inmune de AC neutralizantes a los 6-7 días post-inoculación). (2005) Vacuna contra la PPC, a partir del gen de la glicoproteína E2 del virus, con la que se ha obtenido protección total frente al desafío letal (los animales desarrollaron una marcada respuesta de LT cooperadores, y una rápida elevación de los niveles de AC neutralizantes, lo que se correlacionó con la protección ante los síntomas clínicos y la infección viral ).

59 Aves (1993) Vacuna contra la influenza aviar, a partir del gen de la hemaglutinina viral , donde la administración de 2 dosis de 100 μg cada una separadas 1 mes entre sí, confirió protección ante el desafío 1-2 semanas después de la segunda dosis. (1996) Vacuna contra la enfermedad de Newcastle, a partir del gen clonado que codifica para la proteína F del virus ( con la peculiaridad que tan sólo los animales vacunados con ADN lineal obtuvieron la protección deseada; lo cual avala el hecho de que la inducción de inmunidad mucosal en el modelo de infección por este virus, resulta decisiva).

60 Equino (2003) Vacuna contra Influenza Equina y Tétanos , a partir de Virus canaripox recombinante Influenza A equina; se utiliza en Inmunización activa ( efectos visibles 14 días después) de los caballos de > 4 meses contra la influenza equina para la reducción de los signos clínicos y de la excreción vírica después de la infección y contra el tétanos para prevenir la mortalidad, su efecto dura 5 meses después de la primera vacunación y 1 año después de la tercera vacunación.

61 Gatos y perros (1997) “Recombitek” (vacuna contra moquillo canino),a partir de canarypox inocuo donde se ha implantado material genético de vmc, con esta vacuna se ha conseguido evitar todos los problemas post-vacunales típicos de las vacunas tradicionales. (2005)“Purevax FelV” (vacuna contra la leucemia felina),a partir de canaripox recombinante que expresa los genes env y gag del FeLV-A (en condiciones de campo, tan sólo subgrupo A es infeccioso y la inmunización frente a este subgrupo induce una protección total contra los subgrupos A, B y C, porqué después de la inoculación, el virus expresa las proteínas protectoras, pero sin replicarse) y consigue inducir inmunidad contra la leucemia felina.

62 ESTUDIOS ACTUALES

63 Ejemplos de empresas privadas que trabajan actualmente en el desarrollo de nuevas vacunas:
Large Scale Biology corp ( que trabaja en vacunas personalizadas contra linfoma no-hodgkins, papilomavirus y parvovirus. Chlorogen ( que trabaja en vacunas contra cólera, ántrax y peste.

64 Ejemplos de empresas e instituciones que actualmente estudian nuevas vacunas:
Universidad de Navarra ( que estudia vacunas en plantas vía transformación cloroplástica del tabaco. INIA ( que estudia el diseño de vacunas recombinantes mejoradas y el desarrollo de vacunas contra PPA. Fort Dodge Veterinaria S.A que estudia vacunas para prevención de infecciones entéricas y respiratorias en humanos, nueva vacuna marcadora para PPC, … . CNB ( que estudia vacuna contra infecciones entéricas y respiratorias en porcino, vectores vacunales basados en genoma de coronaviurs para porcino, … .

65 Maltagen Forschung GmBH (http://www. maltagen
Maltagen Forschung GmBH ( que estudia vacuna contra hepatitis ( a partir de la cebada). Biocem S.A que estudia vacuna contra la rabia a partir del maíz y el tabaco. Genomine inc. ( que estudia vacunas comestibles (veterinarias y humanas). Guardian Biotechnologies ( que estudia vacunas a partir de melón coreano, tabaco, cánola y mostaza. Nexgen biotechnologies inc. ( que estudia vacunas veterinarias comestibles a partir de melón coreano. Dow agrosciences ( que estudia vacunas veterinarias a partir de maíz.

66 Algunos de los últimos estudios
(2005) “Recombinant vaccines based on translocated effector proteins of salmonella pathogenicity island 2” (Erlangen –Alemania-). La Salmonella viva entérica atenuada es útil como portadora de antígenos heterólogos para la vacunación , la eficacia de estas fue demostrada con experimentos de vacunación usando antígenos protectores de Lysteria Monocytogenes.

67 (2006) “Durable HIV-1 antibody and T-cell responses elicited by an adjuvanted multi-protein recombinant vaccine in uninfected human volunteers” (university of Rochester –USA-). Se vacunaron intramuscularmente 48 personas no infectadas de HIV para analizar la presencia de respuestas ( AC y LT) inducidas por la vacuna y como se esperaba no se detectó respuesta de células T CD8 HIV-específicas.

68 (2006) “Evaluation of recombinant BCG expressing rotavirus VP6 as an anti-rotavirus vaccine” (La boratorio nacional de salud de Ciudad del Cabo). BCG recombinante que expresaba el rotavirus VP6 se estudia como vacuna contra rotavirus y los resultados (se observa protección – por tanto inmunidad celular- en ausencia del anticuerpo perceptible del anti-rotavirus en suero o heces) sugieren que el transporte de VP6 a la membrana de BCG es importante para la inducción de una inmunorespuesta protectora.

69 (2006) “Generation and evaluation of a recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine for rabies” (Instituto agrícola de investigación veterinaria –Sudafrica- ). Este estudio intenta demostrar la eficacia e inocuidad del uso de MVA (virus de Ankara modificado) recombinante con un gen de glicoproteina del virus de la rabia administrado vía oral; los resultados demuestran que es inocuo y obtiene respuesta inmunológica humoral pero si se administra periféricamente pero no se obtiene si se administra vía oral.

70 (2007) “Improved formulation of recombinant ricin A-chain vaccine increases its stability and effective antigenicity” ( US Army medical research institute of infectious diseases –USA-). El ricino es una toxina muy potente asociada al bioterrorismo para la cual, aún no existe ninguna vacuna disponible; este estudio se basa en el “prototipo de vacuna recombinante” hecho a partir de cadena A de ricino y se centra en intentar incrementar su estabilidad y efectividad; se llega a la conclusión que la optimización de la adherencia de un antígeno de la proteína al coadyuvante de aluminio puede ser de gran utilidad para alcanzar tal fin.