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1 MS/MS Espectrometría en Tándem: Información estructural de pequeñas moléculas Secuenciación de péptidos Espectrometría de masa.

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1 1 MS/MS Espectrometría en Tándem: Información estructural de pequeñas moléculas Secuenciación de péptidos Espectrometría de masa

2 2 MS/MS: Espectrometría en Tándem Espectrometría de masa Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones hijos m p + m d + + m n 0 Aplicaciones: Identificación de moléculas Secuenciación de péptidos al vuelo Modificaciones posttraduccionales

3 3 MS/MS: Secuenciación peptídica Espectro MS/MS: masa de los fragmentos Mezcla de péptidos MS/MS péptido seleccionado para MS/MS Espectro MS Carlos Cerveñansky Espectrometría de masa

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5 N-terminal C-terminal MS/MS: Espectrometría en Tandem Espectrometría de masa Fragmentación peptídica Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984) La fragmentación más común se da en el enlace peptídico, generando fragmentos b e y

6 6 MS/MS: Espectrometría en Tandem Espectrometría de masa Fragmentación peptídica Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984)

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8 y ionsb ions b1 b2 b3 b4 y4 y3 y2 y1 Espectrometría de masa Las m/z medidas por MS/MS se comparan con tablas de masas teoricas obtenidas con la secuencia del peptido, que puede ser obtenida de bases de datos

9 b1b1 b2b2 b3b3 y1y1 y2y2 y3y3 LF K G GL K F Relative Intensity m/z FLGK ++ FLGK ++ FLGK ++ CID FLGK ++ FLGK ++ FLGK ++ b1b1 b2b2 b3b3 y3y3 y2y2 y1y1 FLGK ++ FLGK + Espectrometría de masa Para asignar los iones b/y tenemos que conocer la secuencia de aa. Se puede hacer secuenciacion de novo pero requiere experimentos adicionales e instrumentos de alta resolucion

10 Fragmentacion de Peptidos por MS/MS His-Gly-Thr-Val-Val-Leu-Thr-Ala-Leu-Gly-Gly-Ile -Leu-Lys b1b4b3b5b6b7b8b9b10b2b11b12b13 y13y10y11y9y8y7y6y5y4y12y3y2y1

11 MS/MS: Espectrometría en Tandem Espectrometría de masa Cómo se hace?

12 12 MS/MS: Espectrometría en Tandem Espectrometría de masa ESI-Q Q 1 Q 2 Q 3 : Triple Cuadrupolo. Q 1 Selecciona el ion molecular padre Q 2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten (CID) Q 3 Analiza los iones hijo Select Parent Fragment Analyse Fragment Masses Q1 Q2Q3

13 13 MS/MS: Espectrometría en Tandem Espectrometría de masa ESI-Q Q 1 Q 2 Q 3 : Triple Cuadrupolo. Q 2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten CID: Collision Induced Dissociation Se usa mucho para realizar cuantificaciones por LC-MS-MS

14 Mass Analysis peptides protein peptides Ionization Digestion m/z MS MS/MS: Espectrometría en Tandem Espectrometría de masa

15 IonizationIsolationFragmentation Mass Analysis protein peptide fragments Digestion peptides m/z MSMS/MS m/z Isolation MS/MS: Espectrometría en Tandem Espectrometría de masa

16 16 MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-IT IT: Trampa de Iones La trampa de iones puede analizar los iones de una muestra MS También puede seleccionar uno, y concentrarlo en la trampa Luego se aceleran los iones para que choquen con Helio y se fragmenten Luego se analizan los iones hijo CID: Collision Induced Dissociation Las trampas de iones tienen capacidad de hacer MS n se seleccionan iones hijo se fragmentan, analizan, seleccionan uno fragmentan, analizan, seleccionan uno hasta que les de la sensibilidad MS 2 Espectrometría de masa

17 Fragment Isolate Parent Ion Intact ions Intact ion Daughters This analysis/isolation/fragmentation can be carried out in an ion trap Tandem en el tiempo Espectrometría de masa

18 18 MS/MS: Espectrometría en Tandem Espectrometría de masa MALDI-TOF Iones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan juntos al reflector y pueden ser analizados por el mismo. PSD: Post Source Decay

19 ESQUEMA: Instrumento de tecnología MALDI-TOF Espectrometría de masa

20 20 Espectrometría de masa

21 Identificación de sitios de modificación Oxidación de citocromo c Y74 Y67 Y48 Y97 Y74 Y67 Y48 Y97 Located in mitochondria, plays an important role in apoptosis intrinsic pathway and has been linked to oxidative stress responses

22 [H 2 O 2 ] 37°C,1 Hr aPLPC TOCL

23 b10 y9 b8 b7 b6 y5 y4 b5 y7 (2+) y5 (2+) y6 (2+) b7-CO (2+) y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1 T---E---R---E---D---L---I---A---Y*--L---K---K b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12 Y+16

24 GAPDH Reaction with Nitro-oleic acid Batthyany J.Biol.Chem. 2006, p.20450

25 25 Identificación de proteínas Peptide mass fingerprinting y proteomica Espectrometría de masa

26 26 Identificación de proteínas Espectrometría de masa

27 Huella peptídica Cada proteína, cortada con una proteasa de especificidad conocida, da una serie de péptidos de masa determinada que puede ser usada para identificar la proteína (huella peptídica) En el 2003 se terminó de secuenciar el primer genoma humano. De la secuencia del ADN se puede determinar la secuencia de aminoácidos de todas las proteínas potencialmente expresables. Hoy contamos con cerca de Genomas secuenciados, y mas por salir.

28 Mass (m/z) 0 6.0E % Intensity Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = , 60367] Espectro de masa del citocromo c de caballo A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico

29 GDVEKGKKIFVQKCAQCHTVEKGGKHKTGPNL HGLFGRKTGQAPGFTYTDANKNKGITWK EETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLI AYLKKATNE Secuencia AA citocromo c de caballo Digestión in silico por tripsina (corta despues de K o R) Lista de péptidos teóricos GDVEK GDVEKGK GK GKK IFVQK IFVQKCAQCHTVEK CAQCHTVEK CAQCHTVEKGGK GGKHK TGPNLHGLFGRK TGQAPGFTYTDANK NKGITWK EETLMEYLENPK KYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE Se calculan las masas teóricas para todos los péptidos posibles y se comparan con los resultados de MS de cytc tratado con tripsina

30 Mass (m/z) 0 2.0E % Intensity Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = , 19883] B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico

31 Niveles de información……… en la caracterización de proteínas por MS. medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental medidas de masas en mapeo peptídico 5-20 valores experimentales secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales …mejora en cantidad y calidad de la información

32 Peptide fragmentation fingerprinting Enzymatic digestion In-silico digestion Protein(s)Peptides MS/MS spectra of peptides Ions peaklists …MAIILAGGHSVRFGPKAF AEVNGETFYSRVITLESTNM FNEIIISTNAQLATQFKYPN VVIDDENHNDKGPLAGIYTI MKQHPEEELFFVVSVDTPMI TGKAVSTLYQFLV … - MAIILAGGHSVR - FGPK - AFAEVNGETFYSR - VITLESTNMFNEIIIK - YPNVVIDDENNDK … Sequence database entry Theoretical peaklist Theoretical proteolytic peptides Match Result: ranked list of peptide and protein candidates Theoretical fragmented peptides -MAIILAG -MAIILA -MAIIL -MAII -MAI -M -AIILAG In-silico fragmentation PFF = ion search MS/MS database matching

33 Proteoma El término proteoma fue acuñado por Marc Wilkins en 1995, como el complemento de PROTEínas al genOMA Es el producto final del genoma más variedad Es una entidad dinámica Fenotipo Modificaciones posttraduccionales No todos los genes se expresan como proteínas en todos los estadios/tipos celulares

34 Proteoma Del gen a la proteína final, pueden ocurrir muchas modificaciones que no son predecibles por la secuencia de ADN original 1 gen ya no equivale a 1 proteína

35 Sujetos de estudio de la Proteómica Identificación de Proteínas (pept mass fingerprint) Comparación de niveles de expresión de proteinas Función de Proteinas Modificaciones posttraduccionales de Proteinas Localización y Compartimentalización de Proteinas Interacciones Proteina-Proteina

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37 Quantitative proteomics

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40 MS-Imaging

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43 Conclusiones La espectrometría de masa es una técnica con muchísimas aplicaciones y aún tiene mucho potencial por desarrollar

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