Espectrometría en Tándem:

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1 Espectrometría en Tándem:
Espectrometría de masa MS/MS Espectrometría en Tándem: Información estructural de pequeñas moléculas Secuenciación de péptidos

2 MS/MS: Espectrometría en Tándem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tándem Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo y estudiar la formación de iones “hijos” mp+  md+ + mn0 Aplicaciones: Identificación de moléculas Secuenciación de péptidos “al vuelo” Modificaciones posttraduccionales

3 MS/MS: Secuenciación peptídica
Espectrometría de masa MS/MS: Secuenciación peptídica Mezcla de péptidos MS/MS + 1 péptido seleccionado para MS/MS Espectro MS/MS: masa de los fragmentos Espectro MS Carlos Cerveñansky

4 Espectrometría de masa

5 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem Fragmentación peptídica C-terminal N-terminal La fragmentación más común se da en el enlace peptídico, generando fragmentos b e y Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984)

6 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem Fragmentación peptídica Roepstorff & Fohlman, Biomed.Mass Spec., 11,601(1984)

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8 b1 y4 b2 y3 b3 y2 b4 y1 Espectrometría de masa y ions b ions
Las m/z medidas por MS/MS se comparan con tablas de masas teoricas obtenidas con la secuencia del peptido, que puede ser obtenida de bases de datos

9 CID Espectrometría de masa
F L G K + CID b1 b2 b3 y3 y2 y1 Para asignar los iones b/y tenemos que conocer la secuencia de aa. b1 b2 b3 y1 y2 y3 L F K G Relative Intensity m/z Se puede hacer secuenciacion “de novo” pero requiere experimentos adicionales e instrumentos de alta resolucion

10 Fragmentacion de Peptidos por MS/MS
His-Gly-Thr-Val-Val-Leu-Thr-Ala-Leu-Gly-Gly-Ile -Leu-Lys b1 b4 b3 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b2 b11 b12 b13 y13 y10 y11 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y12 y3 y2 y1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Relative Abundance 395.2 y9 b4 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z 887.6 986.6 774.5 1186.7 494.3 1168.7 1085.7 607.4 1243.7 673.5 1006.6 1119.6 779.5 476.3 589.3 984.6 708.4 466.3 885.6 1184.7 772.5 y13 y12 y12* y11 y10 y8 y7 b13 b12 b11 b10 b8 b7 b6 b5 b6* b5* a5 a12

11 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem Cómo se hace?

12 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-Q Q1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q1 Selecciona el ion molecular “padre” Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten (CID) Q3 Analiza los iones “hijo” Select Parent Fragment Analyse Fragment Masses Q1 Q2 Q3

13 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-Q Q1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas para que los iones acelerados choquen y se fragmenten CID: Collision Induced Dissociation Se usa mucho para realizar cuantificaciones por LC-MS-MS

14 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem peptides peptides + + + + + + + + Ionization Mass Analysis protein Digestion MS m/z

15 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem peptide fragments protein peptides ++ + + + ++ ++ + + + + + + + + ++ + Mass Analysis Digestion Ionization Isolation Fragmentation MS Isolation MS/MS m/z m/z m/z

16 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem ESI-IT IT: Trampa de Iones La trampa de iones puede analizar los iones de una muestra  MS También puede seleccionar uno, y concentrarlo en la trampa Luego se aceleran los iones para que choquen con Helio y se fragmenten Luego se analizan los iones hijo CID: Collision Induced Dissociation Las trampas de iones tienen capacidad de hacer MSn  se seleccionan iones hijo  se fragmentan, analizan, seleccionan uno  fragmentan, analizan, seleccionan uno  hasta que les de la sensibilidad MS2

17 Tandem en el tiempo Espectrometría de masa
Isolate Parent Ion Intact ions Intact ion This analysis/isolation/fragmentation can be carried out in an ion trap Fragment 426.7 Daughters

18 MS/MS: Espectrometría en Tandem
Espectrometría de masa MS/MS: Espectrometría en Tandem MALDI-TOF Iones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo. PSD: Post Source Decay

19 ESQUEMA: Instrumento de tecnología MALDI-TOF
Espectrometría de masa ESQUEMA: Instrumento de tecnología MALDI-TOF Camera Laser plate Pumping Beam guide Timed ion selector Reflector Linear detector Extraction grids

20 Espectrometría de masa

21 Identificación de sitios de modificación Oxidación de citocromo c
Located in mitochondria, plays an important role in apoptosis intrinsic pathway and has been linked to oxidative stress responses Y74 Y67 Y48 Y97 Y74 Y67 Y48 Y97

22 aPLPC TOCL [H2O2] 37°C,1 Hr

23 T---E---R---E---D---L---I---A---Y*--L---K---K
b6 y4 Y+16 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1 T---E---R---E---D---L---I---A---Y*--L---K---K b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12 y5 b7-CO (2+) y7 (2+) b5 y6 (2+) b7 y5 (2+) b8 b10 y9

24 GAPDH Reaction with Nitro-oleic acid
Batthyany J.Biol.Chem , p.20450

25 Identificación de proteínas
Espectrometría de masa Identificación de proteínas Peptide mass fingerprinting y proteomica

26 Identificación de proteínas
Espectrometría de masa Identificación de proteínas

27 Huella peptídica Cada proteína, cortada con una proteasa de especificidad conocida, da una serie de péptidos de masa determinada que puede ser usada para identificar la proteína (huella peptídica) En el 2003 se terminó de secuenciar el primer genoma humano. De la secuencia del ADN se puede determinar la secuencia de aminoácidos de todas las proteínas potencialmente expresables. Hoy contamos con cerca de Genomas secuenciados, y mas por salir.

28 Espectro de masa del citocromo c de caballo
A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico 5000 7000 9000 11000 13000 15000 Mass (m/z) 6.0E+4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = , 60367]

29 Secuencia AA citocromo c de caballo
GDVEKGKKIFVQKCAQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGFTYTDANKNKGITWK EETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE Digestión in silico por tripsina (corta despues de K o R) Lista de péptidos teóricos GDVEK GDVEKGK GK GKK IFVQK IFVQKCAQCHTVEK CAQCHTVEK CAQCHTVEKGGK GGKHK TGPNLHGLFGRK TGQAPGFTYTDANK NKGITWK EETLMEYLENPK KYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE Se calculan las masas teóricas para todos los péptidos posibles y se comparan con los resultados de MS de cytc tratado con tripsina

30 B. Molécula digerida con tripsina
B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico 1000 1160 1320 1480 1640 1800 Mass (m/z) 2.0E+4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = , 19883] 163 3 . 8 2

31 Niveles de información……… en la caracterización de proteínas por MS.
medida de masa de una molécula entera valor experimental medidas de masas en mapeo peptídico valores experimentales secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales …mejora en cantidad y calidad de la información

32 Peptide fragmentation fingerprinting
PFF = ion search MS/MS database matching Protein(s) Peptides Ions peaklists MS/MS spectra of peptides Enzymatic digestion Result: ranked list of peptide and protein candidates Match In-silico fragmentation MAIILAG MAIILA MAIIL MAII MAI M AIILAG …MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV … In-silico digestion - MAIILAGGHSVR - FGPK - AFAEVNGETFYSR - VITLESTNMFNEIIIK - YPNVVIDDENNDK … Theoretical fragmented peptides Sequence database entry Theoretical proteolytic peptides Theoretical peaklist

33 Proteoma El término “proteoma” fue acuñado por Marc Wilkins en 1995, como el complemento de PROTEínas al genOMA Es el producto final del genoma  más variedad Es una entidad dinámica  Fenotipo Modificaciones posttraduccionales No todos los genes se expresan como proteínas en todos los estadios/tipos celulares

34 Proteoma Del gen a la proteína final, pueden ocurrir muchas modificaciones que no son predecibles por la secuencia de ADN original 1 gen ya no equivale a 1 proteína

35 Sujetos de estudio de la Proteómica
Identificación de Proteínas (pept mass fingerprint) Comparación de niveles de expresión de proteinas Función de Proteinas Modificaciones posttraduccionales de Proteinas Localización y Compartimentalización de Proteinas Interacciones Proteina-Proteina

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37 Quantitative proteomics

38 Quantitative proteomics

39 Identified yeast proteins per copy number for shotgun proteomics and two tagging approaches. MS, mass spectrometry; GFP, green fluorescent protein; TAP, tandem affinity purification. (b) Using SILAC Haploid to diploid ratios for the yeast proteome. Proteins are color coded according to their haploid/diploid expression ratio as in the color legend in panel c. (c) Pheromone response pathway with fold change color coded for each of its members according their haploid/diploid expression ratio (see color legend). Haploid/diploid ratios are shown as red numbers. MAPK, mitogen-activated protein kinase. (d ) Abundances of proteins detected by targeted proteomics using MRM assays according to Reference 70. Colored labels indicate the copy numbers per yeast cell of the proteins that they point to. Proteins for which the absolute abundance was measured are indicated on top of the graph (open circles).

40 MS-Imaging

41 MS-Imaging

42 Advancing Cell Biology Through Proteomics in
Space and Time (PROSPECTS) Molecular & Cellular Proteomics 11.3 0.1074/mcp.O –1

43 Conclusiones La espectrometría de masa es una técnica con muchísimas aplicaciones y aún tiene mucho potencial por desarrollar

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