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Silvia Fernanda Jiménez Yánez

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Presentación del tema: "Silvia Fernanda Jiménez Yánez"— Transcripción de la presentación:

1 Silvia Fernanda Jiménez Yánez
“Caracterización molecular de cepas de Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR en muestras recolectadas en cuatro comunidades del cantón General Villamil Playas, provincia del guayas” Silvia Fernanda Jiménez Yánez Directora: Dra. María Augusta Chávez M.Sc. Codirector: Ing. Pedro Romero

2 IMPORTANCIA Alta prevalencia en América Latina
Control del vector por pleomorfismo natural y trasmisión Caracterización molecular Correlación entre la severidad de la enfermedad y el hospedero Relación entre la infección y/o las patologías asociadas Similitud biológica, bioquímica y molecular entre cepas del parásito Síntomas de la enfermedad que causan problemas digestivos y cardiacos

3 Vectores de importancia en Ecuador
Autor/año Lugar Especie vector Parásito encontrado Villacis & Grijalva, col ( ) Manabí Rodnius ecuadoriensis Trypanosoma cruzi Abad-Franch y col (2001) Panstrongylus howardi Guevara y col (1999) Guayas Triatoma dimidiata Triatoma dimidiata, Rhodnius ecuadoriensis (sierra y costa) Rhodnius pictipes, R. robustus, Panstrongylus geniculatus (amazonía) Riesgo potencial Rhodnius ecuadoriensis Panstrongylus geniculatus Triatoma dimidiata

4 Protozoario Hemoflagelado
MARCO TEORICO Trypanosoma cruzi PARÁSITO Reino Protista Sub Reino Protozoa Orden Kinetoplastida Familia Trypanosomatidae Género Trypanosoma Especie cruzi Sección Stercoraria------heces del vector Protozoario Hemoflagelado

5 MARCO TEORICO CICLO DE VIDA alargado con un gran núcleo central
deficiente capacidad de reproducción flagelado, alargado no tiene capacidad para dividirse, Invade otras células penetra e infecta al hospedero sangre circulante del mamífero y en las heces del insecto Sin movimiento; gran núcleo cerca del cinetoplasto a manera de disco replicación, por división binaria simple división binaria longitudinal. parte anterior del intestino del insecto medios de cultivo

6 MARCO TEORICO Picadura del vector Trypanosoma cruzi Madre al feto Mal manejo de muestras Transfusiones y trasplantes VECTOR Triatoma dimidiata endémico Ecuador 15 especies Picadura deyecciones del vector Chagomas o Signo de Romaña

7 RESERVORIOS DEL VECTOR
MARCO TEORICO RESERVORIOS DEL VECTOR ambiente favorable para su reproducción y alimentación Escombros rocas apiladas, cuevas de murciélagos y agujeros en los arboles ocupados por mamíferos y aves, aéreas de mucha maleza herbácea, dentro de los domicilios que presentan imperfecciones en su construcción

8 Métodos directos MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO 90% - 10% 90% - 10% < 60%
Examen directo de sangre fresca Método de stout Técnicas moleculares Hemocultivo Gota gruesa y extendida de sangre periférica 90% - 10% 90% - 10% < 60% 90% - 40% - 100%

9 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
100% Métodos serológicos IFI HAI ELISA Métodos indirectos Xenodiagnóstico 98% 96% 100% - 36%

10 OBJETIVO GENERAL Caracterizar las cepas de Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR, en muestras recolectadas en cuatro comunidades del cantón General Villamil Playas, en la provincia de Guayas.

11 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Colectar y extraer los triatominos infectados con el parásito Trypanosoma cruzi en las comunidades Barrio Lindo, El Morrón, Cruz Roja y Altamira dentro del cantón General Villamil Playas. Extraer el ADN de Trypanosoma cruzi, mediante la técnica Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamílico de las muestras analizadas de triatominos recolectados. Caracterizar molecularmente a Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR, de las muestras de ADN obtenidas del análisis de los insectos triatominos recolectados, para obtener resultados más confiables y específicos. Comparar la técnica microscópica con la técnica de PCR de las muestras analizadas. Realizar un estudio complementario de la prevalencia del parásito Trypanosoma cruzi en el vector triatomino en las muestras recolectadas.

12 HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN
El parásito Trypanosoma cruzi tipo II está presente, de manera significativa y distinta, en todas las muestras de vectores Triatoma dimidiata recolectadas en las cuatro comunidades del cantón General Villamil Playas, provincia del Guayas.

13 METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS
Cantón Playas - Guayas SNEM Recolección

14 METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS
Recolección y análisis del material fecal de triatominos Alimentación Clasificación Extracción del material fecal

15 FASE DE LABORATORIO Heces + suero fisiológico Microscopía de luz 40X
1,5 mL heces + suero fisiológico estéril 3mL heces+ 10 mL LIT

16 METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS

17 METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS
Extracción de ADN F - C - AI Buffer de lisis EDTA y NaCl Proteinasa K y SDS Rx frio etanol absoluto Buffer TE 1X centrifugacion e Incubación PCR Reactivos Amplificación

18 Cuantificación y purificación del ADN
METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS Cuantificación y purificación del ADN Gel de Agarosa 1,5% Muestras Corrida

19 Estreptomicina (10000 ug/ml) Penicilina (10000 units/mg)
METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS Titulo Reactivos Cantidad NaCl 7.5g KCl 0.4g Triptosa 5g Sucrosa 2g Liver infusión Hemina 20mg Suero Fetal Bovino 70ml Estreptomicina (10000 ug/ml) 0.1ml Penicilina (10000 units/mg) Gentamicina (10000 ug/ml) H2O Destilada 1000ml

20 Condiciones de Recoleccion de triatominos
Tabla de tesis

21 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
PORCENTAJE DE TRIATOMINOS INFECTADOS CON Trypanosoma cruzi Insectos vectores positivos y = 149 Triatomas total muestreados n = 206 Prevalencia global 72.33% Nivel de confianza NDC = 95.00% Distribución normal z = 1.95 Error E = 6.11% Low L = 66.22% Up U = 78.44% Según Autor (2004)

22 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis de la prevalencia de Triatominos positivos con microscopia en cada comunidad Barrio Lindo El Morrón Altamira Cruz Roja 67 8 9 65 112 11 74 59.8% 72.7% 100% 87.8% NDC 95.00% Z 1.95 E 143.6% 4.16% 0% 1.17% L -83.78% -343.5% 100.0% -29.9% U 203.4% 489.0% 205.6%

23 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Barrio ADN prom DE Mín Max Barrio Lindo 30.9 257.3 El Morrón 30.8 155 Atamira 63.9 223.1 Cruz Roja 37.6 750.4 Q1 = 63.9 Q2 = 122.1 Q3 = 179.9

24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
PCR DE MUESTRAS ANALIZADAS CON S35 Y S36 Barrio Identificación con primers S35 Y S36 Barrio Lindo 24% (6/25) El Morrón Altamira Cruz Roja 28% (7/25) Total 25 7 6 6 6

25 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers S35 y S36
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers S35 y S36 Temperatura Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 95°C 5min 1 ciclo Desnaturalización 95°C 1min Alineamiento 60°C 30 ciclos Extensión 72°C Extensión final 4°C Hasta el análisis de los productos del gel de agarosa Reactivos Concentración final Rx N°22 dNTP Mix 1 MgCl2 (25mM) GoTaq 5X Buffer 3 Primer 1 (2.5uM) 0,4 Primer 2 (2.5uM) GoTaq Polymerasa 0,125 Agua ultra pura 8,10 ADN 2 Volumen final 16 PCR Amplificación

26 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CUANTIFICACIÓN DE ADN Muestra Barrio ng/uL Heces Barrio Lindo 30.9 36.1 191.1 257.3 165.8 65.9 El Morrón 30.8 97.8 83.9 80.2 125.2 155 Altamira 134.2 179.9 178.4 223.1 63.9 122.1 Cruz Roja 750.4 529 516.8 46.9 54.8 37.6 94.9 ng/uL

27 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
330pb 330pb 330pb

28 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers TC, TC1 y TC2
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers TC, TC1 y TC2 Temperatura Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 94°C 5min 1 ciclo Desnaturalización 94°C 30min Alineamiento 55°C 30 ciclos Extensión 72°C 45min Extensión final 4°C Hasta el análisis de los productos del gel de agarosa Reactivos Concentración final dNTP Mix 0,125 MgCl2 (25mM) 1,25 GoTaq 5X Buffer 2,5 Primer 1 (10 uM) Primer 2 (10 uM) Primer 3 (10 uM) GoTaq Polymerasa 0,05 Agua ultra pura 5,7 ADN Volumen final 12,5 PCR Amplificación

29 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
300pb 300pb Trypanosoma cruzi Tipo II

30 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Comunidades Muestras amplificadas con primers TC, TC1 y TC2 Muestras no amplificadas 1. Barrio Lindo 6 2. El Morrón 4 2 3. Altamira 4. Cruz Roja 7 Barrios

31 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Secuencia primers Nucleótidos (BLAST) S35 1 ataatgtacg ggggagatgc atgatttttg gccccaaaag ttgaacgccc ctcccaaaac 61 aagaatttcg taattttcgg aaccccttta tgtgtaattt ataccaccta tacctctacc 121 ataccaccaa cacaacacta ccatcaagaa tacagaaact atagtatcat caatatcaag 181 ataacacact caatgcaatc atacaatgcc ccacagaaca taacattttg tgttgtaaac 241 tatatcatta gtatctactc tataaattat tattccggta cccctctcac ctctacatta 301 caccaacccc aatcgaaccc ccacctcccc gaaaaattca caaaatcaat aaaataatgt 361 acgggggaga tgcatgattt ttggccccaa aagttgaacg cccctcccaa aaccaacatt 421 ttctgaaatt ccacatcttt ttcaaccatg ttataccata ccacaatcta ttacccacca 481 tccaaccaaa caccaaatta taaaatgtaa ctgaatacat aactacaata acgttaacaa 541 atctcatcca caaactcaca ccatgttctc ttacacaatg ttctcaacta catcattata 601 attacagaaa atatactata tcctaaagac tcattataat atccaaaacc caccactcca 661 cctcccttat attacaccaa ccccaatcga acc Secuencia primers Nucleótidos (BLAST) S36 1 ataatgtacg ggggagatgc atgatttttc cgccccaaat ttgaacgccc ctcccaaaac 61 cacattttcc gaatcctcat aacccattcc taacccttac acaacattat aagatttatc 121 aacaaactat agaataataa agaatatatt gtctaattta tctatacaaa catatcttat 181 ctcttatatc atagttaata taatacacct ctacatacta taaacataca taacacctct 241 acaccatatt caattccaaa ttacactaca caccacccta tcctacccac cacattacca 301 cctctatatt acaccaaccc caatcgaacc Secuencia primers Nucleótidos (BLAST) TC2 1 acctgcaggc acacgtgtgt gtgtgtatgt atgtgtgtgt gccccaccca cctccggctc 61 cttcatgttt gtgtcgtcgc tgcccttgtc tgcgcaagca cggtgtcctg tcgtgtccgt 121 ctcgctgctt tgtgttctcg cactccaccg cgtgttttac ggtgttgcct gcgttttttg 181 gtgtttttct gcttttttcc cgtcttttgg ctcctcgcac tgaaccgcct gcacacaccg 241 ctccgcacgc attagtcgcg tgtgttccgc cccccgacac tttctgtggc gctgatcggg 301 cgactccgcc ag

32 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFECCIÓN EXPERIMENTAL RATONES Los ratones infectados con Trypanosoma cruzi, presentaron parasitemia visible, sin embargo la infección de los ratones no pudo ser confirmada mediante PCR, con primers específicos de Trypanosoma cruzi ( pb), debido a contaminación en la muestra. MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo líquidos LIT, no presentaron parasitemia visible debido a la falta de asepsia previa a la inoculación, o probablemente la cantidad de heces inoculadas en cada tubo con el medio liquido LIT fue demasiado alta para que los antibióticos realizaran un trabajo eficiente al momento de mantener estéril al medio. Por lo tanto no se observaron fragmentos de bandas amplificadas para la presencia de Trypanosoma cruzi en el medio de cultivo.

33 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Se encontró que el 72.33% de vectores analizados tienen a Trypanosoma cruzi presente en las muestras. El nivel socioeconómico bajo en las comunidades y su forma de vida es un riesgo potencial importante para el continuo desarrollo de la enfermedad. Con el presente estudio, los métodos de diagnóstico podrán ser más eficientes dando un control casi personalizado a los pacientes. El sistema de control en el vector podría ser de mayor eficiencia si se toma en cuenta el ciclo biológico del insecto dentro de los reservorios selváticos y domésticos. Evitar la deforestación, la cual afecta los nichos ecológicos de los vectores, causando cambios en el medio en el que habitan para evitar la migración a espacios domiciliares. Otra medida de control es la colaboración e intervención de las autoridades locales para que ayuden a crear programas de mejora habitacional en toda la zona endémica para la enfermedad de Chagas.

34 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Control del vector con insecticidas específicos y control a los pobladores Realizar controles dos veces al año capacitando al grupo de SNEM Facilitar el equipo necesario para realizar los controles del vector en las distintas poblaciones Realizar sondeos a las personas mediante técnicas de laboratorio para controlar la enfermedad de Chagas Dar informes actualizados de estudios recientes para estableces un vinculo entre los investigadores y la enfermedad Mantener la bioseguridad pertinente en el manejo de material infeccioso para evitar los contagios indirectos Realizar estudios de caracterización genética para otros tipos de Trypanosomas, ya que se ha demostrado que no solo puede existir una sola clase de Trypanosoma dentro de un vector.

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