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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE TRYPANOSOMA CRUZI MEDIANTE LA TÉCNICA DE PCR EN MUESTRAS RECOLECTADAS EN CUATRO COMUNIDADES DEL CANTÓN GENERAL VILLAMIL.

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1 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE TRYPANOSOMA CRUZI MEDIANTE LA TÉCNICA DE PCR EN MUESTRAS RECOLECTADAS EN CUATRO COMUNIDADES DEL CANTÓN GENERAL VILLAMIL PLAYAS, PROVINCIA DEL GUAYAS Silvia Fernanda Jiménez Yánez Directora: Dra. María Augusta Chávez M.Sc. Codirector: Ing. Pedro Romero

2 IMPORTANCIA Alta prevalencia en América Latina Control del vector por pleomorfismo natural y trasmisión Caracterización molecular Correlación entre la severidad de la enfermedad y el hospedero Relación entre la infección y/o las patologías asociadas Similitud biológica, bioquímica y molecular entre cepas del parásito Síntomas de la enfermedad que causan problemas digestivos y cardiacos

3 Triatoma dimidiata Rhodnius ecuadoriensis Panstrongylus geniculatus Autor/añoLugarEspecie vectorParásito encontrado Villacis & Grijalva, col ( ) ManabíRodnius ecuadoriensisTrypanosoma cruzi Abad-Franch y col (2001)ManabíPanstrongylus howardiTrypanosoma cruzi Guevara y col (1999)GuayasTriatoma dimidiataTrypanosoma cruzi Triatoma dimidiata, Rhodnius ecuadoriensis (sierra y costa) Rhodnius pictipes, R. robustus, Panstrongylus geniculatus (amazonía) Riesgo potencial Vectores de importancia en Ecuador

4 Reino Protista Sub Reino Protozoa OrdenKinetoplastida FamiliaTrypanosomatidae Género Trypanosoma Especie cruzi PARÁSITO Protozoario Hemoflagelado Trypanosoma cruzi Sección Stercoraria------heces del vector MARCO TEORICO

5 CICLO DE VIDA alargado con un gran núcleo central deficiente capacidad de reproducción penetra e infecta al hospedero flagelado, alargado no tiene capacidad para dividirse, Invade otras células sangre circulante del mamífero y en las heces del insecto división binaria longitudinal. parte anterior del intestino del insecto medios de cultivo Sin movimiento; gran núcleo cerca del cinetoplasto a manera de disco replicación, por división binaria simple MARCO TEORICO

6 Trypanosoma cruzi Picadura del vector Madre al feto Mal manejo de muestras Transfusiones y trasplantes Picadura deyecciones del vector Chagomas o Signo de Romaña Triatoma dimidiata endémico Ecuador 15 especies VECTOR MARCO TEORICO

7 RESERVORIOS DEL VECTOR rocas apiladas, cuevas de murciélagos y agujeros en los arboles ocupados por mamíferos y aves, aéreas de mucha maleza herbácea, dentro de los domicilios que presentan imperfecciones en su construcción ambiente favorable para su reproducción y alimentación MARCO TEORICO Escombros

8 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Examen directo de sangre fresca Método de stout Técnicas moleculares Hemocultivo Gota gruesa y extendida de sangre periférica Métodos directos 90% - 10% < 60% 90% - 10% 90% - 40%- 100%

9 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Métodos serológicos IFIHAIELISA 98% 100% 96% Métodos indirectos Xenodiagnóstico 100% - 36%

10 Caracterizar las cepas de Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR, en muestras recolectadas en cuatro comunidades del cantón General Villamil Playas, en la provincia de Guayas. OBJETIVO GENERAL

11 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Colectar y extraer los triatominos infectados con el parásito Trypanosoma cruzi en las comunidades Barrio Lindo, El Morrón, Cruz Roja y Altamira dentro del cantón General Villamil Playas. Extraer el ADN de Trypanosoma cruzi, mediante la técnica Fenol-Cloroformo- Alcohol Isoamílico de las muestras analizadas de triatominos recolectados. Caracterizar molecularmente a Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR, de las muestras de ADN obtenidas del análisis de los insectos triatominos recolectados, para obtener resultados más confiables y específicos. Comparar la técnica microscópica con la técnica de PCR de las muestras analizadas. Realizar un estudio complementario de la prevalencia del parásito Trypanosoma cruzi en el vector triatomino en las muestras recolectadas.

12 HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN El parásito Trypanosoma cruzi tipo II está presente, de manera significativa y distinta, en todas las muestras de vectores Triatoma dimidiata recolectadas en las cuatro comunidades del cantón General Villamil Playas, provincia del Guayas.

13 METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS Cantón Playas - Guayas SNEM Recolección

14 METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS Recolección y análisis del material fecal de triatominos Clasificación Alimentación Extracción del material fecal

15 FASE DE LABORATORIO 1,5 mL heces + suero fisiológico estéril 3mL heces+ 10 mL LIT Heces + suero fisiológico Microscopía de luz 40X

16 METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS

17 Extracción de ADN F - C - AI Buffer de lisis EDTA y NaCl Proteinasa K y SDS Rx frio etanol absoluto Buffer TE 1X centrifugacion e Incubación PCR ReactivosAmplificación

18 Cuantificación y purificación del ADN Gel de Agarosa 1,5% MuestrasCorrida METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS

19 ReactivosCantidad NaCl7.5g KCl0.4g Triptosa5g Sucrosa2g Liver infusión5g Hemina20mg Suero Fetal Bovino70ml Estreptomicina (10000 ug/ml)0.1ml Penicilina (10000 units/mg)0.1ml Gentamicina (10000 ug/ml)0.1ml H 2 O Destilada1000ml METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS Titulo

20 Condiciones de Recoleccion de triatominos Tabla de tesis

21 PORCENTAJE DE TRIATOMINOS INFECTADOS CON Trypanosoma cruzi RESULTADOS Y DISCUSIÓN Insectos vectores positivosy =149 Triatomas total muestreadosn =206 Prevalencia global 72.33% Nivel de confianzaNDC =95.00% Distribución normalz =1.95 ErrorE =6.11% LowL =66.22% UpU =78.44% Según Autor (2004)

22 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Barrio LindoEl MorrónAltamiraCruz Roja %72.7%100%87.8% Análisis de la prevalencia de Triatominos positivos con microscopia en cada comunidad NDC95.00% Z1.95 E143.6%4.16%0%1.17% L-83.78%-343.5%100.0%-29.9% U203.4%489.0%100.0%205.6%

23 BarrioADN promDEMínMax Barrio Lindo El Morrón Atamira Cruz Roja Q1 =63.9 Q2 =122.1 Q3 =179.9 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

24 BarrioIdentificación con primers S35 Y S36 Barrio Lindo24% (6/25) El Morrón24% (6/25) Altamira24% (6/25) Cruz Roja28% (7/25) Total PCR DE MUESTRAS ANALIZADAS CON S35 Y S36 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

25 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers S35 y S36 Reactivos Concentración final Rx N°22 dNTP Mix1 MgCl2 (25mM)1 GoTaq 5X Buffer3 Primer 1 (2.5uM)0,4 Primer 2 (2.5uM)0,4 GoTaq Polymerasa0,125 Agua ultra pura8,10 ADN2 Volumen final16 TemperaturaTiempoCiclos Desnaturalización inicial 95°C 5min1 ciclo Desnaturalización 95°C 1min Alineamiento 60°C 1min30 ciclos Extensión 72°C 1min Extensión final 72°C 5min1 ciclo 4°C Hasta el análisis de los productos del gel de agarosa RESULTADOS Y DISCUSIÓN PCR Amplificación

26 MuestraBarriong/uL HecesBarrio Lindo30.9 HecesBarrio Lindo36.1 HecesBarrio Lindo191.1 HecesBarrio Lindo257.3 HecesBarrio Lindo165.8 HecesBarrio Lindo65.9 HecesEl Morrón30.8 HecesEl Morrón97.8 HecesEl Morrón83.9 HecesEl Morrón80.2 HecesEl Morrón125.2 HecesEl Morrón155 HecesAltamira134.2 HecesAltamira179.9 HecesAltamira178.4 HecesAltamira223.1 HecesAltamira63.9 HecesAltamira122.1 HecesCruz Roja750.4 HecesCruz Roja529 HecesCruz Roja516.8 HecesCruz Roja46.9 HecesCruz Roja54.8 HecesCruz Roja37.6 HecesCruz Roja94.9 CUANTIFICACIÓN DE ADN RESULTADOS Y DISCUSIÓN ng/uL

27 330pb RESULTADOS Y DISCUSIÓN

28 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers TC, TC1 y TC2 Reactivos Concentració n final dNTP Mix0,125 MgCl2 (25mM)1,25 GoTaq 5X Buffer2,5 Primer 1 (10 uM)0,125 Primer 2 (10 uM)0,125 Primer 3 (10 uM)0,125 GoTaq Polymerasa0,05 Agua ultra pura5,7 ADN2,5 Volumen final12,5 TemperaturaTiempoCiclos Desnaturalizació n inicial 94°C 5min1 ciclo Desnaturalizació n 94°C 30min Alineamiento 55°C 30min30 ciclos Extensión 72°C 45min Extensión final 72°C 5min1 ciclo 4°CHasta el análisis de los productos del gel de agarosa RESULTADOS Y DISCUSIÓN PCR Amplificación

29 300pb Trypanosoma cruzi Tipo II RESULTADOS Y DISCUSIÓN

30 Comunidades Muestras amplificadas con primers TC, TC1 y TC2 Muestras no amplificadas 1. Barrio Lindo60 2. El Morrón42 3. Altamira06 4. Cruz Roja07 Barrios

31 Secuencia primers Nucleótidos (BLAST) S35 1 ataatgtacg ggggagatgc atgatttttg gccccaaaag ttgaacgccc ctcccaaaac 61 aagaatttcg taattttcgg aaccccttta tgtgtaattt ataccaccta tacctctacc 121 ataccaccaa cacaacacta ccatcaagaa tacagaaact atagtatcat caatatcaag 181 ataacacact caatgcaatc atacaatgcc ccacagaaca taacattttg tgttgtaaac 241 tatatcatta gtatctactc tataaattat tattccggta cccctctcac ctctacatta 301 caccaacccc aatcgaaccc ccacctcccc gaaaaattca caaaatcaat aaaataatgt 361 acgggggaga tgcatgattt ttggccccaa aagttgaacg cccctcccaa aaccaacatt 421 ttctgaaatt ccacatcttt ttcaaccatg ttataccata ccacaatcta ttacccacca 481 tccaaccaaa caccaaatta taaaatgtaa ctgaatacat aactacaata acgttaacaa 541 atctcatcca caaactcaca ccatgttctc ttacacaatg ttctcaacta catcattata 601 attacagaaa atatactata tcctaaagac tcattataat atccaaaacc caccactcca 661 cctcccttat attacaccaa ccccaatcga acc Secuencia primersNucleótidos (BLAST) S36 1 ataatgtacg ggggagatgc atgatttttc cgccccaaat ttgaacgccc ctcccaaaac 61 cacattttcc gaatcctcat aacccattcc taacccttac acaacattat aagatttatc 121 aacaaactat agaataataa agaatatatt gtctaattta tctatacaaa catatcttat 181 ctcttatatc atagttaata taatacacct ctacatacta taaacataca taacacctct 241 acaccatatt caattccaaa ttacactaca caccacccta tcctacccac cacattacca 301 cctctatatt acaccaaccc caatcgaacc Secuencia primersNucleótidos (BLAST) TC2 1 acctgcaggc acacgtgtgt gtgtgtatgt atgtgtgtgt gccccaccca cctccggctc 61 cttcatgttt gtgtcgtcgc tgcccttgtc tgcgcaagca cggtgtcctg tcgtgtccgt 121 ctcgctgctt tgtgttctcg cactccaccg cgtgttttac ggtgttgcct gcgttttttg 181 gtgtttttct gcttttttcc cgtcttttgg ctcctcgcac tgaaccgcct gcacacaccg 241 ctccgcacgc attagtcgcg tgtgttccgc cccccgacac tttctgtggc gctgatcggg 301 cgactccgcc ag RESULTADOS Y DISCUSIÓN

32 INFECCIÓN EXPERIMENTAL RATONES Los ratones infectados con Trypanosoma cruzi, presentaron parasitemia visible, sin embargo la infección de los ratones no pudo ser confirmada mediante PCR, con primers específicos de Trypanosoma cruzi ( pb), debido a contaminación en la muestra. MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo líquidos LIT, no presentaron parasitemia visible debido a la falta de asepsia previa a la inoculación, o probablemente la cantidad de heces inoculadas en cada tubo con el medio liquido LIT fue demasiado alta para que los antibióticos realizaran un trabajo eficiente al momento de mantener estéril al medio. Por lo tanto no se observaron fragmentos de bandas amplificadas para la presencia de Trypanosoma cruzi en el medio de cultivo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

33 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Se encontró que el 72.33% de vectores analizados tienen a Trypanosoma cruzi presente en las muestras. El nivel socioeconómico bajo en las comunidades y su forma de vida es un riesgo potencial importante para el continuo desarrollo de la enfermedad. Con el presente estudio, los métodos de diagnóstico podrán ser más eficientes dando un control casi personalizado a los pacientes. El sistema de control en el vector podría ser de mayor eficiencia si se toma en cuenta el ciclo biológico del insecto dentro de los reservorios selváticos y domésticos. Evitar la deforestación, la cual afecta los nichos ecológicos de los vectores, causando cambios en el medio en el que habitan para evitar la migración a espacios domiciliares. Otra medida de control es la colaboración e intervención de las autoridades locales para que ayuden a crear programas de mejora habitacional en toda la zona endémica para la enfermedad de Chagas.

34 Control del vector con insecticidas específicos y control a los pobladores Realizar controles dos veces al año capacitando al grupo de SNEM Facilitar el equipo necesario para realizar los controles del vector en las distintas poblaciones Realizar sondeos a las personas mediante técnicas de laboratorio para controlar la enfermedad de Chagas Dar informes actualizados de estudios recientes para estableces un vinculo entre los investigadores y la enfermedad Mantener la bioseguridad pertinente en el manejo de material infeccioso para evitar los contagios indirectos Realizar estudios de caracterización genética para otros tipos de Trypanosomas, ya que se ha demostrado que no solo puede existir una sola clase de Trypanosoma dentro de un vector. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

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