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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

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Presentación del tema: "DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA"— Transcripción de la presentación:

1 DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
ESTANDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE UN PROTOCOLO DE HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) PARA MEDIR COENZIMA Q10 EN PLAQUETAS. MYRIAN IBETH CHILUIZA JÁCOME SANGOLQUÍ, 14 DE AGOSTO DEL 2012

2 ÍNDICE INTRODUCCIÓN MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN
CONCLUSIONES RECOMENDACIONES

3 (Fuente: Coenzyme Q10 Nutrition Health, 2012)
INTRODUCCIÓN Es una quinona isoprenoide no proteica, liposoluble, y móvil, que se encuentra prácticamente en todas las membranas celulares. Sirve como transportador de electrones y colector de átomos de hidrógeno en la cadena respiratoria mitocondrial. La designación química de su forma natural es: 2,3 dimetoxi-5-metil-6-poliprenil parabenzoquinona. Coenzima Q10 (Fuente: Coenzyme Q10 Nutrition Health, 2012)

4 Funciones de la CoQ10 En la cadena de transporte de electrones.
Como antioxidante. Señalización celular y expresión génica.

5 Relación con procesos patológicos
Parkinson Restablecimiento de la actividad de la CTE en los fibroblastos. Disminución de apoptosis en neuronas dopaminérgicas. Isquemia miocárdica Acción protectora en daño oxidativo. Prevención de la disfunción del endotelio. Reducción de RL. Alzheimer Protección a cels. del neuroblastoma de efectos neurotóxicos. Atenuación de la producción de H2O2 proveniente de la fosforilación oxidativa.

6 Matrices de medición Plaquetas, músculo, linfocitos
Concentración Q10 plasmática no refleja la concentración intracelular de tejidos de interés médico. Necesidad otras matrices Potenciales sustitutos del estado de la Q10 en el tejido. Plaquetas, músculo, linfocitos Células predilectas por ser ricas en mitocondrias, fácilmente aislables, presentar características similares a las neuronas. Plaquetas

7 Objetivos Objetivo general: Estandarizar y validar un protocolo de medición de Coenzima Q10 en plaquetas mediante la metodología de HPLC.

8 Objetivos específicos:
Establecer que no existan interferencias de otros compuestos con la medición del analito (coenzima Q10) en esta metodología. Demostrar que los resultados de la prueba son directamente proporcionales a la concentración del principio activo, garantizando la capacidad del método para obtener resultados lineales. Comprobar que el método planteado es exacto y produce resultados consistentes.

9 Hipótesis: El protocolo óptimo para la medición de coenzima Q10, sobre la base de la metodología HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) permite la medición precisa y confiable de los niveles de CoQ10 en plaquetas.

10 MATERIALES Y MÉTODOS Dos Fases
Estandarización Se utilizaron pools de muestras, así como, una muestra control para optimizar todos los parámetros de influencia del método. Validación Con el protocolo estandarizado se realizaron todas las pruebas de calidad establecidas por el manual del Eurachem.

11 Estandarización Se probaron volúmenes de sangre citratada de 2,5 y 4,5 ml. Volúmenes de partida del PRP de: 400ul, 600ul y 800ul. @ PRP: se probaron centrifugaciones de 4000rpm, 10000rpm, 11000rpm y 14000rpm con tiempos de 10, 15 y 20 minutos cada una. Volumen de adición del 1-propanol al pellet: 200ul, 400ul y 800ul. @ pellet de plaquetas con 1-propanol: se probaron centrifugaciones de 4000rpm, 10000rpm y 14000rpm con 10 y 15 minutos de centrifugado. Procesamiento del pellet con y sin lavado con el buffer Tris 10 mM pH= 7,40. Volumen de la solución de reconstitución del residuo seco. Se utilizó 100 y 200ul de la fase móvil metanol: 1-propanol relación 60/40.

12 Estandarización Condiciones cromatográficas
Fase móvil: metanol 60%: 1-propanol 40%, metanol 70%: 1-propanol 30% y metanol 80%: 1-propanol 20%. Flujo: se probaron flujos de 0,3ml/min, 0,4ml/min y 0,5ml/min. Temperatura de la muestra. Se utilizó 4ºC ±2 y 8ºC ±2. Temperatura de la columna. Se utilizó 25ºC ±5 y 30ºC ±5. Volumen de inyección: 10ul, 20ul, 50ul y 90ul. Absorbancia: se detectaron las muestras a longitud de onda abierta de 210 a 400nm.

13 Objetivos de la validación:
Incertidumbre del método menor al 30%. Robustez del método dentro del rango: 90 a 110. Precisión: rango de repetibilidad y reproducibilidad menor a 0,05. Linealidad (correlación) igual o mayor a un R2 de 0,99. Veracidad (porcentaje de recuperación) mayor o igual al 90%.

14 Validación Exactitud, precisión y robustez

15 Validación Límite de detección y cuantificación
10 blancos de muestra Concentración del 10% del promedio de las muestras LD = Xblancos + 3Sblancos LC = Xblancos + 10Sblancos Lectura 10 estándares preparados al límite de detección y 5 estándares preparados al límite de cuantificación, el día 1 de esta prueba. Y el día 8 se corrieron 5 estándares preparados al límite de cuantificación.

16 Validación Linealidad Confirmación de identidad
Se prepararon 4 curvas con el siguiente rango de concentraciones: 0,1uM - 0,5uM – 0,75uM – 1uM – 1,5uM y 2uM. Se corrieron los siguientes reactivos: 1-propanol grado HPLC, metanol de la misma pureza, y fase móvil de las muestras (metanol 60%: 1-propanol 40%).

17 FUENTES DE INCERTIDUMBRE CERTIFICADOS O RESOLUCIÓN DE EQUIPOS
Validación Incertidumbre FUENTES DE INCERTIDUMBRE ALEATORIAS REPRODUBILIDAD, REPETIBILIDAD, EXACTITUD, LD, LC, RANGO (K,ΔØ,R2), LINEALIDAD, R2. CRITERIO: DESVIACIÓN ESTÁNDAR CERTIFICADOS O RESOLUCIÓN DE EQUIPOS BALANZA, MICROPIPETAS, RESOLUCIÓN DE LA BALANZA Y PUREZA DEL STD. CRITERIO: INCERTIDUMBRE

18 Muestras Criterios de inclusión: Sexo: masculino o femenino.
Nacionalidad ecuatoriana. De 18 a 30 años de edad. Sin trastornos metabólicos aparentes. Sin ingesta de medicamentos. Previa autorización. 35 muestras

19 RESULTADOS Estandarización de la técnica
Principales parámetros modificados Fase móvil FASE °T/R (minutos) ÁREA (unidades AU) ALTURA (unidades AU) 1 4,09 315395 17827 4,14 315555 18168 4,15 317202 18074 2 2,84 315582 23160 316290 23598 316345 23287 318437 24070 318066 23658 3 6,52 310986 12636 6,58 311198 12736 310664 12669 Nomenclatura: fase 1: metanol 70%: 1-propanol 30%; fase 2: metanol 60%: 1-propanol 40% y fase 3: metanol 80%: 1-propanol 20%.

20 Estandarización de la técnica
Principales parámetros modificados Velocidad de flujo °T/R (minutos) ÁREA (unidades AU) ALTURA FLUJO (ml/min) 3,75 418357 24419 0,3 3,76 419074 25135 420555 24451 2,84 315582 23160 0,4 316290 23598 316345 23287 318437 24070 318066 23658 2,29 255801 22196 0,5 254987 22341 255382 22403

21 Estandarización de la técnica
Protocolo óptimo de determinación de CoQ10 en plaquetas

22 Estandarización de la técnica
Protocolo óptimo de determinación de CoQ10 en plaquetas Condiciones cromatográficas: Fase móvil: metanol 60%: 1-propanol 40%. Flujo: 0,4 ml/min. Volumen de inyección: 90 ul. Corrida isocrática. Temperatura de la muestra: 8ºC ± 2. Temperatura de la columna: 25ºC ± 5. Absorbancia: 275nm.

23 Validación de la técnica
Exactitud y robustez IDENTIFICACIÓN CONCENTRACIÓN MUESTRA CONCENTRACIÓN MUESTRA ESPIQUEADA PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN PERSONA N. 1 0,746 1,741 92,991 0,588 1,728 104,587 0,7 1,722 93,761 0,665 1,736 98,257 0,667 1,739 98,349 0,691 1,747 96,881 0,646 1,74 100,367 0,698 1,73 94,679 0,675 1,714 95,321 0,686 1,723 95,138 PERSONA N. 2 0,836 1,578 98,933 0,797 1,514 95,600 0,809 1,53 96,133 0,807 1,532 96,667 0,818 1,539 0,829 1,554 0,827 1,552 0,832 1,556 96,533 0,837 PROMEDIO 0, 1, 96,803 DESV. ESTÁNDAR 0, 0, 2,577 LIC 91,753 LSC 101,854

24 Validación de la técnica
Precisión Prueba F para igualdad de varianzas (criterio de repetibilidad). VARIABLE GRUPO (1) (2) N VAR F p PRUEBA CONCEN. {alto} {bajo} 10 1,10E-04 4,30E-06 2,47E+01 0,0001 Bilateral {medio} 1,70E-03 0,06 0,0003 2,60E-03 <0,0001 Prueba F para igualdad de varianzas (criterio de reproducibilidad). VARIABLE GRUPO (1) (2) N VAR F p PRUEBA CONCEN. {alto} {bajo} 10 0,03 1,10E-06 23487,75 <0,0001 Bilateral {medio} 0,97 0,969 COENCEN. 4,10E-05

25 Validación de la técnica
Precisión Rangos de aceptación del método. REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD RANGOS DE ACEPTACION 0,004 0,02 0,002 0,037 bajo alto

26 Límite de detección y límite de cuantificación del método.
Validación de la técnica Sensibilidad del método: límite de detección y cuantificación. Concentración de los blancos de muestra. IDENTIFICACIÓN CONCENTRACIÓN BLANCOS DE MUESTRA 0,018 0,016 0,017 0,015 0,022 PROMEDIO DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,002 LD = Xblancos + 3Sblancos LC = Xblancos + 10Sblancos Límite de detección y límite de cuantificación del método. CRITERIO CONCENTRACIÓN (umol/L) LD 0,023+/-0,002 LC 0,038+/-0,002

27 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN CONCENTRACIÓN (umol/L)
Validación de la técnica Sensibilidad del método: límite de detección y cuantificación. Comportamiento de estándares preparados al límite de detección y cuantificación del método. CRITERIO LÍMITE DE DETECCIÓN RANGO LD LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN LC CONCENTRACIÓN (umol/L) 0,027 0,002 0,040 0,025 0,038 0,023 0,026 0,001 0,024 0,039

28 CONCENTRACIÓN (umol/L)
Validación de la técnica Linealidad. ID. CURVA CONCENTRACIÓN (umol/L) ÁREA ECUACIÓN R2 1 0,1 15127 y = x ,4 0,9999 0,5 90261 0,75 137817 184656 1,5 283384 2 374396 14837 y = x ,7 0,9989 88543 136326 178873 289226 382861 3 15749 y = x ,8 0,9953 89785 132248 172965 256577 374026 4 10629 y = x 0,9976 76261 122697 157171 263600 353502

29 Validación de la técnica
Linealidad. Curva de calibración tipo del método. Límites de aceptación de las curvas de calibración del método. PROMEDIO DESV STD LIC LSC PENDIENTE 187948,4565 6014,769486 176159,5083 199737,4047 CORTE EJE Y -8186,536719 4087,291072 -16197,62722 -175, COEFICIENTE DE CORRELACIÓN 0, 0, 0, 1

30 Validación de la técnica
Confirmación de identidad: selectividad/especificidad Cromatograma de la inyección de metanol grado HPLC. Cromatograma de la inyección de la fase móvil del método (metanol 60%: 1-propanol 40%). Cromatograma de la inyección de 1-propanol grado HPLC.

31 incertidumbre estándar del método: 0,07 incertidumbre expandida: 0,14.
Validación de la técnica Incertidumbre Desviaciones estándares de las fuentes aleatorias de incertidumbre del método (Evaluación Tipo A). Incertidumbres asociadas a las fuentes sistemáticas de incertidumbre del método (Evaluación Tipo B). CRITERIO DESVIACIÓN ESTÁNDAR Reproducibilidad 0, Repetibilidad 0, Exactitud 0, LD 0, LC 0, Rango 0, Linealidad MATERIAL INCERTIDUMBRE UNIDADES Balanza 0,00001 ml Micropipeta 0,0005 Resolución balanza 0,00005 Estándar CoQ10 0, incertidumbre estándar del método: 0,07 incertidumbre expandida: 0,14.

32 Muestras Concentración promedio de CoQ10: 0,69uM.
No hubo correlaciones significativas entre: edad, género o número de plaquetas con la concentración de CoQ10 intracelular.

33 DISCUSIÓN Estandarización Fase móvil. Velocidad del flujo.
Ventajas: disminución del tiempo de retención, incremento del área y altura de las muestras y mayor compatibilidad con las mismas. Desventaja: tiempo de vida media de la solución patrón en el 1-propanol. Velocidad del flujo. Tiempo de retención corto, características cromatográficas deseables. Volumen de PRP, sangre total, 1-propanol y fase móvil (extracción Q10). El incremento del volumen del PRP y la sangre total, así como, la disminución del volumen de reconstitución (fase móvil) de la muestra, permitió una mayor concentración de la CoQ10. La disminución del 1-propanol no trajo efectos adversos y fue necesaria para disminuir el tiempo de secado. Volumen de inyección. Componente clave para la visualización óptima del pico cromatográfico de coenzima Q10 de las muestras.

34 Validación Exactitud. Precisión. Robustez. Sensibilidad.
Porcentaje de recuperación del 96,8%, cumple con objetivos de validación del método y las normas internacionales. En comparación con Contin (2011): 89 – 95,3%, éste método es más exacto. Precisión. Lím. Repetibilidad: 0, ,02, Lím. Reproducibilidad: 0,002 – 0,037. Lim. Repetibilidad Contin: 0,04 – 0,057, Lím. Reproducibilidad: 0,043 – 0,063. Robustez. De 91,75 a 101,85% de recuperación, cumple con objetivo de validación (90 – 110%), recomendado por el Eurachem. Sensibilidad. Dos criterios: límite de detección de 5,31 picomol/1E9 plaquetas y límite de cuantificación de 8,04 picomol/1E9 plaquetas. En comparación con Contin: LD de 21 picomol/1E9 plaquetas y LC de 84 picomol/1E9 plaquetas.

35 Validación Linealidad. Confirmación de identidad. Incertidumbre.
Coeficiente de correlación promedio: 0,998, cumple con objetivos de validación y normas internacionales (Eurachem, ICH y USP). Confirmación de identidad. No existe ninguna interferencia al tiempo de retención de la CoQ10. Incertidumbre. Incertidumbre expandida del método: 14%, cumple con objetivos de validación y criterios del Eurachem. Muestras. Promedio concentración: 0,7uM. No correlación entre: edad, género, número de plaquetas y concentración Q10 en plaquetas. Carta de control:30 muestras bajo control y 5 muestras atípicas.

36 CONCLUSIONES Se estandarizó y validó un protocolo de medición de coenzima Q10 en plaquetas, mediante la metodología de HPLC. Se estableció que no existieron interferencias de otros compuestos en la medición del analito, mediante esta metodología. Se demostró que los resultados de la prueba son directamente proporcionales a la concentración del principio activo, garantizando la capacidad del método para obtener resultados lineales. Se comprobó que el método planteado es exacto y produce resultados consistentes. Se evidenció que la fase móvil implementada brinda importantes ventajas sobre la fase móvil original. El volumen de inyección, así como los volúmenes de plasma rico en plaquetas y de redisolución del residuo seco, determinaron la visualización óptima del pico de coenzima Q10. La exactitud, precisión, linealidad, y sensibilidad del presente método, presentan mejores resultados que los obtenidos en el protocolo propuesto por Contin (2011).

37 Se deben crear estrategias de verificación del control del método a corto plazo. Así como a largo plazo, para comprobar que la exactitud y precisión del método siguen estando bajo control. Adicionalmente, se deben implantar medidas sistemáticas para el tratamiento de las muestras atípicas o fuera de control. Para la validación de métodos analíticos es necesaria la utilización de instrumentos calibrados y materiales de referencia certificados. Ampliar este estudio con una población representativa del Ecuador para establecer una línea base de la concentración intracelular de la coenzima Q10 en adultos sanos. RECOMENDACIONES

38 AGRADECIMIENTO


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