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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA ESTANDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE UN PROTOCOLO DE HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

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1 DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA ESTANDARIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE UN PROTOCOLO DE HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) PARA MEDIR COENZIMA Q10 EN PLAQUETAS. MYRIAN IBETH CHILUIZA JÁCOME SANGOLQUÍ, 14 DE AGOSTO DEL 2012

2 ÍNDICE INTRODUCCIÓN MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES

3 INTRODUCCIÓN Es una quinona isoprenoide no proteica, liposoluble, y móvil, que se encuentra prácticamente en todas las membranas celulares. Sirve como transportador de electrones y colector de átomos de hidrógeno en la cadena respiratoria mitocondrial. La designación química de su forma natural es: 2,3 dimetoxi-5-metil-6- poliprenil parabenzoquinona. (Fuente: Coenzyme Q10 Nutrition Health, 2012) Coenzima Q10

4 Funciones de la CoQ10 En la cadena de transporte de electrones. Como antioxidante. Señalización celular y expresión génica.

5 Relación con procesos patológicos Parkinson Restablecimiento de la actividad de la CTE en los fibroblastos. Disminución de apoptosis en neuronas dopaminérgicas. Isquemia miocárdica Acción protectora en daño oxidativo. Prevención de la disfunción del endotelio. Reducción de RL. Alzheimer Protección a cels. del neuroblastoma de efectos neurotóxicos. Atenuación de la producción de H 2 O 2 proveniente de la fosforilación oxidativa.

6 Matrices de medición Concentración Q10 plasmática no refleja la concentración intracelular de tejidos de interés médico. Necesidad otras matrices Potenciales sustitutos del estado de la Q10 en el tejido. Plaquetas, músculo, linfocitos Células predilectas por ser ricas en mitocondrias, fácilmente aislables, presentar características similares a las neuronas. Plaquetas

7 Objetivos Objetivo general: Estandarizar y validar un protocolo de medición de Coenzima Q10 en plaquetas mediante la metodología de HPLC.

8 Objetivos específicos: Establecer que no existan interferencias de otros compuestos con la medición del analito (coenzima Q10) en esta metodología. Demostrar que los resultados de la prueba son directamente proporcionales a la concentración del principio activo, garantizando la capacidad del método para obtener resultados lineales. Comprobar que el método planteado es exacto y produce resultados consistentes.

9 Hipótesis: El protocolo óptimo para la medición de coenzima Q10, sobre la base de la metodología HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) permite la medición precisa y confiable de los niveles de CoQ10 en plaquetas.

10 MATERIALES Y MÉTODOS

11 Estandarización

12 Estandarización

13 Objetivos de la validación: Incertidumbre del método menor al 30%. Robustez del método dentro del rango: 90 a 110. Precisión: rango de repetibilidad y reproducibilidad menor a 0,05. Linealidad (correlación) igual o mayor a un R2 de 0,99. Veracidad (porcentaje de recuperación) mayor o igual al 90%.Validación

14 Validación Exactitud, precisión y robustez

15 Límite de detección y cuantificación Validación

16 Linealidad Se prepararon 4 curvas con el siguiente rango de concentraciones: 0,1uM - 0,5uM – 0,75uM – 1uM – 1,5uM y 2uM. Confirmación de identidad Se corrieron los siguientes reactivos: 1-propanol grado HPLC, metanol de la misma pureza, y fase móvil de las muestras (metanol 60%: 1-propanol 40%). Validación

17 Incertidumbre FUENTES DE INCERTIDUMBRE ALEATORIAS REPRODUBILIDAD, REPETIBILIDAD, EXACTITUD, LD, LC, RANGO (K,ΔØ,R 2 ), LINEALIDAD, R 2. CRITERIO: DESVIACIÓN ESTÁNDAR CERTIFICADOS O RESOLUCIÓN DE EQUIPOS BALANZA, MICROPIPETAS, RESOLUCIÓN DE LA BALANZA Y PUREZA DEL STD. CRITERIO: INCERTIDUMBRE Validación

18 Muestras Criterios de inclusión: Sexo: masculino o femenino. Nacionalidad ecuatoriana. De 18 a 30 años de edad. Sin trastornos metabólicos aparentes. Sin ingesta de medicamentos. Previa autorización. 35 muestras

19 RESULTADOS Estandarización de la técnica –Principales parámetros modificados Fase móvil FASE °T/R (minutos) ÁREA (unidades AU) ALTURA (unidades AU) 14, , , , , , , , , , , Nomenclatura: fase 1: metanol 70%: 1-propanol 30%; fase 2: metanol 60%: 1-propanol 40% y fase 3: metanol 80%: 1-propanol 20%.

20 Estandarización de la técnica –Principales parámetros modificados Velocidad de flujo °T/R (minutos) ÁREA (unidades AU) ALTURA (unidades AU) FLUJO (ml/min) 3, ,3 3, ,3 3, ,3 2, ,4 2, ,4 2, ,4 2, ,4 2, ,4 2, ,5 2, ,5 2, ,5

21 Estandarización de la técnica –Protocolo óptimo de determinación de CoQ10 en plaquetas

22 Condiciones cromatográficas: –Fase móvil: metanol 60%: 1-propanol 40%. –Flujo: 0,4 ml/min. –Volumen de inyección: 90 ul. –Corrida isocrática. –Temperatura de la muestra: 8ºC ± 2. –Temperatura de la columna: 25ºC ± 5. –Absorbancia: 275nm. Estandarización de la técnica –Protocolo óptimo de determinación de CoQ10 en plaquetas

23 IDENTIFICACIÓN CONCENTRACIÓN MUESTRA CONCENTRACIÓN MUESTRA ESPIQUEADA PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN PERSONA N. 1 0,7461,74192,991 0,5881,728104,587 0,71,72293,761 0,6651,73698,257 0,6671,73998,349 0,6911,74796,881 0,6461,74100,367 0,6981,7394,679 0,6751,71495,321 0,6861,72395,138 PERSONA N. 2 0,8361,57898,933 0,7971,51495,600 0,8091,5396,133 0,8071,53296,667 0,8181,53996,133 0,8291,55496,667 0,8271,55296,667 0,8321,55696,533 0,8371,55495,600 PROMEDIO 0, , ,803 DESV. ESTÁNDAR 0, , ,577 LIC 91,753 LSC 101,854 Validación de la técnica –Exactitud y robustez

24 Validación de la técnica –Precisión VARIABLE GRUPO (1) GRUPO (2) N (1) N (2) VAR (1) VAR (2) FpPRUEBA CONCEN.{alto}{bajo}10 1,10E- 04 4,30E- 06 2,47E+010,0001Bilateral CONCEN.{alto}{medio}10 1,10E- 04 1,70E- 03 0,060,0003Bilateral CONCEN.{bajo}{medio}10 4,30E- 06 1,70E- 03 2,60E-03 <0,000 1 Bilateral Prueba F para igualdad de varianzas (criterio de repetibilidad). VARIABLE GRUPO (1) GRUPO (2) N (1) N (2) VAR (1) VAR (2) FpPRUEBA CONCEN.{alto}{bajo}10 0,03 1,10E ,75<0,0001Bilateral CONCEN.{alto}{medio}10 0,03 0,970,969Bilateral COENCEN.{bajo}{medio}10 1,10E- 06 0,034,10E-05<0,0001Bilateral Prueba F para igualdad de varianzas (criterio de reproducibilidad).

25 Validación de la técnica –Precisión REPETIBILIDADREPRODUCIBILIDAD RANGOS DE ACEPTACION 0,0040,020,0020,037 bajoaltobajoalto Rangos de aceptación del método.

26 Validación de la técnica –Sensibilidad del método: límite de detección y cuantificación. IDENTIFICACIÓNCONCENTRACIÓN BLANCOS DE MUESTRA 0,018 0,016 0,018 0,017 0,015 0,016 0,022 0,015 0,018 PROMEDIO0,017 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,002 Concentración de los blancos de muestra. LD = X blancos + 3S blancos LC = X blancos + 10S blancos CRITERIO CONCENTRACIÓN (umol/L) LD0,023+/-0,002 LC0,038+/-0,002 L í mite de detecci ó n y l í mite de cuantificaci ó n del m é todo.

27 Validación de la técnica –Sensibilidad del método: límite de detección y cuantificación. CRITERIO LÍMITE DE DETECCIÓN RANGO LD LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN RANGO LC CONCENTRACIÓN (umol/L) 0,027 0,002 0,040 0,002 0,0250,038 0,025 0,002 0,040 0,002 0,0230,038 0,026 0,002 0,038 0,001 0,0240,039 0,027 0,002 0,039 0,001 0,0250,038 0,026 0,001 0,040 0,001 0,0270,039 Comportamiento de estándares preparados al límite de detección y cuantificación del método.

28 ID. CURVA CONCENTRACIÓN (umol/L) ÁREAECUACIÓNR2R2 1 0, y = x ,40,9999 0, , , , y = x ,70,9989 0, , , , y = x ,80,9953 0, , , , y = x ,9976 0, , , Validación de la técnica –Linealidad.

29 Validación de la técnica –Linealidad. PROMEDIODESV STDLICLSC PENDIENTE187948, , , ,4047 CORTE EJE Y-8186, , , , COEFICIENTE DE CORRELACIÓN 0, , , Límites de aceptación de las curvas de calibración del método. Curva de calibración tipo del método.

30 Validación de la técnica –Confirmación de identidad: selectividad/especificidad Cromatograma de la inyección de metanol grado HPLC. Cromatograma de la inyección de 1- propanol grado HPLC. Cromatograma de la inyección de la fase móvil del método (metanol 60%: 1-propanol 40%).

31 Validación de la técnica –Incertidumbre CRITERIO DESVIACIÓN ESTÁNDAR Reproducibilidad0, Repetibilidad0, Exactitud0, LD0, LC0, Rango0, Linealidad0, Desviaciones estándares de las fuentes aleatorias de incertidumbre del método (Evaluación Tipo A). MATERIALINCERTIDUMBREUNIDADES Balanza0,00001ml Micropipeta0,0005ml Resolución balanza0,00005ml Estándar CoQ100, ml Incertidumbres asociadas a las fuentes sistemáticas de incertidumbre del método (Evaluación Tipo B). incertidumbre estándar del método: 0,07 incertidumbre expandida: 0,14.

32 Muestras –Concentración promedio de CoQ10: 0,69uM. –No hubo correlaciones significativas entre: edad, género o número de plaquetas con la concentración de CoQ10 intracelular.

33 DISCUSIÓN Fase móvil. Ventajas: disminución del tiempo de retención, incremento del área y altura de las muestras y mayor compatibilidad con las mismas. Desventaja: tiempo de vida media de la solución patrón en el 1-propanol. Velocidad del flujo. Tiempo de retención corto, características cromatográficas deseables. Volumen de PRP, sangre total, 1-propanol y fase móvil (extracción Q10). El incremento del volumen del PRP y la sangre total, así como, la disminución del volumen de reconstitución (fase móvil) de la muestra, permitió una mayor concentración de la CoQ10. La disminución del 1-propanol no trajo efectos adversos y fue necesaria para disminuir el tiempo de secado. Volumen de inyección. Componente clave para la visualización óptima del pico cromatográfico de coenzima Q10 de las muestras. Estandarización

34 Validación Exactitud. Porcentaje de recuperación del 96,8%, cumple con objetivos de validación del método y las normas internacionales. En comparación con Contin (2011): 89 – 95,3%, éste método es más exacto. Precisión. Lím. Repetibilidad: 0, ,02, Lím. Reproducibilidad: 0,002 – 0,037. Lim. Repetibilidad Contin: 0,04 – 0,057, Lím. Reproducibilidad: 0,043 – 0,063. Robustez. De 91,75 a 101,85% de recuperación, cumple con objetivo de validación (90 – 110%), recomendado por el Eurachem. Sensibilidad. Dos criterios: límite de detección de 5,31 picomol/1E9 plaquetas y límite de cuantificación de 8,04 picomol/1E9 plaquetas. En comparación con Contin: LD de 21 picomol/1E9 plaquetas y LC de 84 picomol/1E9 plaquetas.

35 Validación Linealidad. Coeficiente de correlación promedio: 0,998, cumple con objetivos de validación y normas internacionales (Eurachem, ICH y USP). Confirmación de identidad. No existe ninguna interferencia al tiempo de retención de la CoQ10. Incertidumbre. Incertidumbre expandida del método: 14%, cumple con objetivos de validación y criterios del Eurachem. Muestras. Promedio concentración: 0,7uM. No correlación entre: edad, género, número de plaquetas y concentración Q10 en plaquetas. Carta de control:30 muestras bajo control y 5 muestras atípicas.

36 CONCLUSIONES Se estandarizó y validó un protocolo de medición de coenzima Q10 en plaquetas, mediante la metodología de HPLC. Se estableció que no existieron interferencias de otros compuestos en la medición del analito, mediante esta metodología. Se demostró que los resultados de la prueba son directamente proporcionales a la concentración del principio activo, garantizando la capacidad del método para obtener resultados lineales. Se comprobó que el método planteado es exacto y produce resultados consistentes. Se evidenció que la fase móvil implementada brinda importantes ventajas sobre la fase móvil original. El volumen de inyección, así como los volúmenes de plasma rico en plaquetas y de redisolución del residuo seco, determinaron la visualización óptima del pico de coenzima Q10. La exactitud, precisión, linealidad, y sensibilidad del presente método, presentan mejores resultados que los obtenidos en el protocolo propuesto por Contin (2011).

37 Se deben crear estrategias de verificación del control del método a corto plazo. Así como a largo plazo, para comprobar que la exactitud y precisión del método siguen estando bajo control. Adicionalmente, se deben implantar medidas sistemáticas para el tratamiento de las muestras atípicas o fuera de control. Para la validación de métodos analíticos es necesaria la utilización de instrumentos calibrados y materiales de referencia certificados. Ampliar este estudio con una población representativa del Ecuador para establecer una línea base de la concentración intracelular de la coenzima Q10 en adultos sanos. RECOMENDACIONES

38 AGRADECIMIENTO


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