Protein Grouping Kerman Aloria Miraflores de la Sierra. Madrid Diciembre 10-11, 2012.

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1 Protein Grouping Kerman Aloria Miraflores de la Sierra. Madrid Diciembre 10-11, 2012

2 2 Protein inference Identificación de proteínas: Identificación de péptidos Perdida de la relación directa entre péptido y proteína Posibles ambigüedades para determinar la presencia de ciertas proteínas en la muestra: - La presencia de un conjunto de péptidos puede ser explicado por diferentes conjuntos de proteínas (ej. isoformas) - Diferentes péptidos pueden explicar un mismo espectro (ej. Leu/Ile)

3 3 Protein inference Objetivo: Gestionar las ambigüedades inherentes a la tecnología shotgun Posibles opciones: Elegir la explicación más sencilla (número mínimo de proteínas) Elegir una proteína representativa por grupo (¿cuál?) Presentar todas las posibles proteínas clasificadas en base a su evidencia experimental

4 4 Protein inference B A C D E F H G J I K N M L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Diferentes escenarios posibles Propuesta de report Minimal list of proteins 1- Protein A Peptides 1, 2 2- Protein B Peptides 3, 4 3- Protein C Peptides 5, 6*, 7* 4- Protein D Peptides 6*, 7*, 8 5- Protein E Peptides 9*, 10*, 11*, 12* Protein F Peptides 9*, 10*, 11*, 12* 6- Protein G Peptides 13, 14*, 15*, 16* 7- Protein I Peptides 17, 18* 8- Protein K Peptides 19*, 20 9- Protein group Protein L Peptides 21*, 22*, 23*, 24* Protein M Peptides 21*, 22*, 23* Protein N Peptides 22*, 23*, 24* Protein count: 9 No conclusive evidence 10- Protein H Peptides 14*, 15*, 16* 11- Protein J Peptides 18*, 19* Nesvizhskii A, Aebersold R: Interpretation of shotgun proteomic data. Mol Cell Proteomics 2005, 4(10):1419–1440 (modificado).

5 5 PAnalyzer PAnalyzer, a software tool to group and report the list of identified proteins into four categories following the recommendations proposed by Nesvizhskii & Aebersold Conclusive protein: a protein identified by at least one unique (distinct, discrete) peptide* Indistinguishable protein: a member of a group of proteins sharing all peptides* that are exclusive to the group Non-conclusive protein: a protein sharing all its matched peptides* with either conclusive or indistinguishable proteins Ambiguous group member: a protein sharing at least one peptide* not matched to either conclusive or indistinguishable proteins *peptides are considered different only if they can be distinguished by evidence in mass spectrum Prieto G. et al.: PAnalyzer: A software tool for protein inference in shotgun proteomics. BMC Bioinformatics 2012

6 6 PAnalyzer Propuesta Nesvizhskii & AebersoldPAnalyzer Distinct Differentiable Indistinguishable Subset Subsumable Group of proteins identified by shared peptides only Conclusive Indistinguishable Non-conclusive Ambiguous group

7 7 MASCOT Para cada una de las entradas debe de haber al menos un péptido diferente Opciones para exportar resultados de MASCOT

8 8 CH60_HUMAN CH60_DROME CH60C_XANAC 3-10 211 2 MASCOT Opciones por defecto CH60C_CAEEL 20-21 22 ProteínasPéptidos (23 péptidos > identity)Protein categoryPeptide category Conclusive Unique: 1, 3-10, 12-23 Shared: 2, 11 23 Conclusive 2112-1911

9 9 MASCOT Include same-set protein hits CH60_HUMAN CH60_DROME CH60C_XANAC 3-10 211 2 CH60C_CAEEL 20-21 22 ProteínasPéptidos (23 péptidos > identity)Protein categoryPeptide category Conclusive Unique: 1, 3-10, 12-22 Shared: 2, 11, 23 23 2112-1911 CH60C_XANC5 23 CH60C_XANC8 23 CH60C_XANCH 23 CH60C_XANCP 23 CH60C_XANOR 23 CH60C_XANOM 23 Indistinguishable

10 10 CH60_HUMAN CH60_CRIGR, MOUSE, RAT CH60_POMPY CH60_EUGGR 1-789-19 1-25-6 1-2 2-7 MASCOT Include same-set protein hits and sub-set protein hits 9-1214-19 CH60_BOVIN 469-1416-19 CH60C_CANAL, PARBR, YEAST, VIBPA, VIBVU, VIBVY 9-19 CH60_CHICK 1-214-19 69-12 CH60C_DROME 211 CH60C_ARATH 219 2 CH60_DROME 20-21211 CH60_CAEEL 222 CH60_XANAC, XANC5, XANC8, XANCH, XANCP, XANOR, XANOM 23 ProteínasPéptidos (23 péptidos > identity)Protein categoryPeptide category Conclusive Non conclusive Conclusive Indistinguishable Unique: 8, 20, 21, 22 Shared: 1-7, 9-19, 23

11 11 MASCOT Es necesario exportar todas las proteínas que contengan algún péptido identificado y agruparlas - Para determinar la evidencia de la presencia de una proteína en la muestra - Para saber si un péptido es realmente único

12 12 Cuestiones a discutir Dos secuencias que machean con un mismo espectro y con el mismo score, unique or indistinguishable? TLNDELELIEGMK TLNDELEIIEGMK score 90 MASCOT Unique PAnalyzer Indistinguishable ¿Hay que tener en cuenta los macheos secundarios si superan el identity threshold? mismo espectro ? péptidoscoreproteína VGGTSDVEVNEK VGGSSEVEVNEK 81 (38) 42 (38) CH60_HUMAN CH60_DROME ?

13 13 Cuestiones a discutir Proteínas indistinguibles con diferentes non-discriminating peptides Protein A Protein B Protein C peptide 2peptide 1 peptide 2peptide 3 Conclusive ProteínasPéptidosProtein category Indistinguishable No hay evidencia que determine la presencia de la proteína B respecto a la proteína C

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