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© 2012 Biotage 1 Biotage Instrumentos, consumibles y experiencia para excelencia en química medicinal.

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1 © 2012 Biotage 1 Biotage Instrumentos, consumibles y experiencia para excelencia en química medicinal

2 © 2012 Biotage 2 Sintesis Organica Asistida con Horno de Microondas

3 © 2012 Biotage 3 Flujo de Trabajo Desarrollo de nuevas Drogas Terapeuticas Sintesis Asistida con Microondas Mejora velocidad de reaccion Mayor rendimiento y pureza Permite reacciones imposibles Reproducible Amplia biblioteca de aplicaciones Mas de 2,000 unidades instaladas y operando Optimizacion Rapida evaporacion de solventes Solventes Organicos y Agua Formato flexible En modo continuo o por lotes Purificacion rapida via cromatografia flash Mas purificacion en menos tiempo Detecta cualquier componente Provee informacion sobre pureza de los compuestos Mas de 2,500 unidades instaladss y operando Purificacion Evaporacion Optimizacion Aditivos de proceso Simples de usar Remocion rapida de productos de reaccion no deseados

4 © 2012 Biotage 4 Introduccion Los reactores de sintesis organica de Biotage utilizan radiacion de microondas como fuente de energia para el lograr alta eficiencia en reaciones quimicas, lo que permite procesos de sintesis mas rapidos y con mayor rendimiento comparado con aquellos en base a calentamiento convencional (conduccion). 4

5 © 2012 Biotage 5 Sintesis Organica Tradicional » Calentamiento a traves de baño de aceite, o con mecheros bunsen » Uso de tecnica de reflujo para trabajar por arriba del punto de ebullicion de los solventes, a falta de viales de reaccion adecuados a alta presion » Sistema fragil, complejo y poco reproducible 5

6 © 2012 Biotage 6 Oscilacion Dipolar Conduccion Ionica Orientacion Molecular = Friccion Molecular = Calor Mecanismo de calentamiento por microondas La radiacion de microondas sobre una muestra determinada, conduce a que sus moleculas vibren y ocurra friccion entre ellas, generando calor desde el interior de la muestra.

7 © 2012 Biotage 7 Calentamiento por MicroondasCalentamiento Convencional Microondas vs. Calentamiento Convencional 7

8 © 2012 Biotage 8 Arrhenius Equation: k = A e –G /RT Beneficios de calentamiento rapido de las reacciones de sintesis 23 o C / 16 h = 110 o C / 2 min Convencional Micro-ondas 23 o C / 12 h = 100 o C / 5 min 70 o C / 16 h = 150 o C / 5 min A partir de la ecuacion de Arrhenius y en relacion a la velocidad de las reacciones, es aceptado el principio de que para una reaccion quimica a temperatura ambiente dada, la velocidad de la reaccion se duplicara por cada incremento de temperatura de 10 grados celsius.

9 © 2012 Biotage 9 Reduccion del tiempo de ciclo de desarrollo de nuevas moleculas 9

10 © 2012 Biotage 10 Ventajas de Sintesis Asistida con horno de Microondas » Tiempos de reaccion mas cortos –Pruebas rapidas de ideas creativas –Incremento en la productividad –Mayor rendimiento, pureza » Mayor diversidad de reacciones posibles –Reacciones imposibles ahora son comunes » Menor uso de reactivos y solventes » Resultados reproducibles » Condiciones de sintesis directamente escalables para sintesis de alto volumen 10

11 © 2012 Biotage 11 De los solventes: Punto de ebullicion Nivel de absorsion de calor Polaridad y variabilidad de polaridad con temperatura Propiedades ionicas Presion de Vapor Elementos a considerar con sintesis asistida con horno de microondas

12 © 2012 Biotage mL Toluene 4.0 Toluene mL DMF Set temp: 200 °C Elementos a considerar con sintesis asistida con horno de microondas Interacciones con co-solventes

13 © 2012 Biotage 13 Ejemplos de reacciones de sintesis asistidas con horno de microondas

14 © 2012 Biotage 14 Reacciones de Reduccion

15 © 2012 Biotage 15 Microwave: 4 min, 140 o C, 71% Microwave: 6 min, 140 o C, 56% Biotage Pathfinder data Hydrogenation

16 © 2012 Biotage 16 Reacciones de oxidacion

17 © 2012 Biotage 17 No.OxidizerSolventTemp ( o C) Time (s) Yield % 1 Pyridinium- dichromate DMF Dess MartinDCE NIS/Bu 4 NIDCE Ce(SO 4 ) 2 /NaBrO 3 CH 3 CN/H 2 O Biotage Pathfinder data Oxidation

18 © 2012 Biotage 18 Microwave: 20 min, 200 o C, 65% Microwave: 400 s, 110 o C, 100% Biotage Pathfinder data Oxidation

19 © 2012 Biotage 19 Oxidation of Alcohols with MP-TsO-TEMPO AlcoholMethodSolventTempTimeYield Non-W CH 3 CNrt16 h95 % W DCM100 o C10 min100 % Non-W CH 3 CNrt16 h99 % W DCM60 o C2 h100 % Non-W CH 3 CNrt16 h70 % W DCM60 o C5 min93% Non-W DCMrt16 h70 % W DCM60 o C1.5 min100 % Non-W DCMrt16 h100 % W DCM60 o C2.5 min100 % Lundin, R.

20 © 2012 Biotage 20 Aminacion Reductiva

21 © 2012 Biotage 21 Reductive Amination –Amines are commonly alkylated via reductive amination using an aldehyde or ketone. –Sodium Cyanoborohydride or Sodium Triacetoxyborohydride are the most common reducing agents used. –Most reductive aminations are accelerated under acidic conditions.

22 © 2012 Biotage 22 MP-CNBH 3 Microwave-assisted Reductive Amination When heating with microwaves, even unreactive ketones reacted smoothly DCM was better than THF in W reactions Combination of secondary amines and unreactive ketones gave little product Pre-mixing amine + Carbonyl made no difference. In some cases this gave lower yields. Temp > 110 o C resulted in amine acetylation Excess amine gave complete conversion however with more acetylated byproduct (Best results with 0.8 eq amine: 1 eq carbonyl)

23 © 2012 Biotage 23 Reductive Amination with MP-CNBH 3 AmineCarbonylConvn. Yield W Yield 79 %98 % 91 %85 % 39 %77 % 63 %79 % 69 %73 % Conventional condition: (1) THF (2) room temp, 16 h Pannagiotis, P. www. biotagepathfinder.com Microwave condition: (1) DCM (2) 110 o C, 5-7 min

24 © 2012 Biotage 24 Amidation

25 © 2012 Biotage 25 ConventionalMicrowave TempRoom Temp100 ºC Time12 h5 min PS-DCC2 eq Comparing Procedures

26 © 2012 Biotage 26 Amide formation D.R. Sauer; D. Kalvin; K.M. Phelan, Org. Lett. 2003, 5, Acylation reaction that combines polymer-assisted solution- phase microwave chemistry with solid-phase extraction Both synthesis and purification takes < 15 min 6 different amines were used HOBt scavenged via Si-carbonate SPE

27 © 2012 Biotage 27 Microwave: 10 min, 200 o C, 82% NEAT Coupling Biotage Pathfinder data

28 © 2012 Biotage 28 Reaciones Catalizadas con Metales y Organometicos

29 © 2012 Biotage 29 Suzuki Coupling 3-Aryl furan-2-ones Optimized reaction conditions found using phenylboronic acid Other Boronic acids yielded 46-63% yield under these conditions Worthington, P. A. et al, Synlett, 2005, 3, SolventBaseTempYield CH 3 CNNa 2 CO 3 90 o Cdecomposition TolueneK 2 CO o C40 % µW,

30 © 2012 Biotage 30 Sonogashira Conventional 100 o C, 24h, 33 % Erdeyle, M; Gogoll, A J. Org. Chem. 2001, 66, Metal Mediated Reaction Microwave 120 o C, 25 min, 87 % Organometalic Reactions

31 © 2012 Biotage 31 Organometalic Reactions Efskind J., Undheim, K. Tetrahedron Lett. 2003, 14, Need 50-80% less catalyst compared to conventional Domino Ring Closing Metathesis

32 © 2012 Biotage 32 Microwaves 60°C, 10min THF Normal atmosphere 89 % Conventionally 0°C, hours Et 2 O Inert atmosphere Avoids the inconvenience of purging N 2 and ice baths. Preparation of Grignard reagent Organometalic Reactions

33 © 2012 Biotage 33 Otras reacciones

34 © 2012 Biotage 34 Solid-supported TsOH Microwave-assisted Pyrazole Synthesis EntryAcidMethodTemptimeYield 1p-TsOH Non-W 100 o C7 h95 % 2p-TsOH W 160 o C5 min61 % 3 Non-W 100 o C6 h84 % 4 W 160 o C5 min95 % Humphries, P. et al, Tetrahedron Lett, 2006 in press µW,

35 © 2012 Biotage 35 Developed & optimized on Emrys Liberator Scaled up 30 times in Advancer; 92% yield (95% purity) PS-Triphenylphosphine One-pot Wittig olefination

36 © 2012 Biotage 36 Rapid Solvent-free Henry Reaction Gan, C.; Chen, X.; Lai, G.; Wang, Z. Synlett 2006,

37 © 2012 Biotage 37 Niementowski condensation Pereira, M. de F.; Picot, L.; Guillon, J.; Leger, J.-M.; Jarry, C.; Thiery, V.; Besson, T. Tetrahedron Letters 2005, 46,

38 © 2012 Biotage 38 One-pot synthesis of 3H-quinazolin-4-ones Liu, J.-F.; Lee, J.; Dalton, A. M.; Bi, G.; Yu, L.; Baldino, C. M.; McElory, E.; Brown, M. Tetrahedron Letters, 2005, 46, This reaction does not work with conventional heating!

39 © 2012 Biotage 39 Hallberg, A. et al J. Org. Chem. 2005, 70, Microwave Assisted Hydrogenolysis 64 % 72 %

40 © 2012 Biotage 40 In Situ Carbonylations under air Larhed, M et al. Synlett. 2004, 13, % Larhed, M et al. J. Org. Chem. 2005, 70, %

41 © 2012 Biotage 41 Cyanation Using PS-PPh 3 Srivastava, R. R.; Collibee, S. E. Tetrahedron Letters 2004, 45, Workup: (1) Filtration (2) Wash resin with Ether (3) Aqueous wash of filtrate (4) Dry and evaporate organic layer

42 © 2012 Biotage 42 Bases de datos de Sintesis Asistidas con horno de microondas » Pathfinder 42

43 © 2012 Biotage 43 Soluciones para Sintesis a traves de Biotage

44 © 2012 Biotage 44 MULTI MODE SINGLE MODE Estrategias/Formatos de radiacion de microondas -Enfoque sobre cavidad de reaccion - Radiacion dispersa en camara -Maxima estabilidad de temperatura - Variabilidad espacial de temperatura sobre el tubo de reaccion dentro de la camara de reaccion

45 © 2012 Biotage 45 Lider en desarrollo de tecnologia de Sintesis asistida con horno de microondas » MAOS (Microwave Assisted Organic Synthesis) » Emrys - Primer sistema single mode desarrollado para laboratorios de investigacion y desarrollo por Personal Chemistry en

46 © 2012 Biotage 46 Initiator: Single Mode compacto » Sistema integrado de bancada » Temperatura maxima de proceso 250 O C » Presion maxima de reaccion 20 Bar 46

47 © 2012 Biotage 47 Initiator + Ultima generacion en MAOS

48 © 2012 Biotage 48 Initiator + » 300 O C y 30 bar » Pantalla de control de expandida a 10 » Opciones de automuestreador de 8 y 60 posiciones 48

49 © 2012 Biotage 49 Viales de Reaccion » Escalables para muestras desde mg hasta gramos » Sellados con para permitir reacciones de manera segura aun con reactivos quimicos peligrosos 49

50 © 2012 Biotage 50 Secuencia de proceso 50 Sintesis en cuatro (4) pasos 1.Colocar barra de agitacion en vial de reaccion 2.Agregar reactivos y solventes 3.Sellar vial 4.Procesar

51 © 2012 Biotage 51 Seguridad, seguridad, seguridad Vials: ~ 40 bar bar 40 – 300 ºC > 800 bar 51

52 © 2012 Biotage 52 Initiator+ Software

53 © 2012 Biotage 53 Interfaz a usuario

54 © 2012 Biotage 54 Editor de experimento

55 © 2012 Biotage 55 Protocolo de reaccion 55

56 © 2012 Biotage 56 Resultados – Reportes de Sintesis 56

57 © 2012 Biotage 57 Resumen » Sintesis Organica Asistida con horno de Microondas es una herramienta versatil para acelerar el desarrollo de reaciones de sintesis quimica » Desarrollo de reacciones de sintesis mas breves, permiten acelerar el ciclo de descubrimiento y la obtencion de nuevos compuestos mas rapidamente » Permite el proceso de reaccciones en condiciones que son imposibles de desarrolar en sintesis convencional de reflujo » Metodo de sintesis que puede ser facilmente integrado con resinas de enlace para limpieza de impurezas, y cromatografia Flash para simplificar reproceso y purificacion

58 © 2012 Biotage 58 Preguntas?

59 © 2012 Biotage 59 Biotage ® Sistemas para Sintesis de Peptidos

60 © 2012 Biotage 60 Antecedentes » La síntesis de péptidos es la producción de péptidos, compuestos orgánicos en los que numerosos aminoácidos se encuentran unidos mediante enlaces peptídicos, llamados también enlaces amida. » Como partes integrales de las proteinas, la técnica de síntesis de péptidos ofrece una ventana para el analisis de proteinas. » Los péptidos juegan un rol significativos en la biología como hormonas, factores de crecimiento, antibióticos, toxinas y neuropéptidos. » Entre las aplicaciones de la síntesis de péptidos se encuentran la de desarrollar péptidos de importancia médica como lo son hormonas y vacunas, también pueden sintetizarse péptidos para producir anticuerpos contra porciones específicas de proteínas o para modificar algunos péptidos naturales con el fin de hacerlos más estables » La tendencia en el desarrollo de nuevas terapias apunta a la utilizacion de drogas en base a peptidos, debido a su elevada actividad y especificidad, baja toxicidad, y alto potencial de diversidad quimica.

61 © 2012 Biotage 61 Sintesis de Petidos en Fase Solida » La síntesis en fase sólida es la técnica más común para la síntesis de péptidos. » Usualmente en este método, los péptidos son sintetizados a partir del extremo del grupo carbonilo (C-terminal) al del grupo amino (N-terminal) de la cadena de aminoácidos » En la síntesis de péptidos, un aminoácido protegido en el grupo amino es unido al material de fase sólida (comúnmente, una resina de poliestireno, o polietilenglicol) formando un enlace covalente entre el grupo carbonilo y la resina, generalmente un enlace amido o éster. » Luego, el grupo amino es desprotegido y se le hace reaccionar con el grupo carbonilo del siguiente aminoácido protegido en el grupo amino. » La fase sólida entonces conduce a un dipéptido. Este ciclo se repite para formar la cadena peptídica deseada. » Una vez que la adición de todos los aminoácidos ha sido completada, se separa el péptido sintetizado de la matriz polimérica.

62 © 2012 Biotage 62 Los 20 Aminoacidos basicos Amino Acid 1-Letter Code 3-Letter CodeSide chain R AlanineAAla-CH 3 CysteineCCys-CH 2 SH Aspartic acidDAsp-CH 2 COOH Glutamic acidEGlu-CH 2 CH 2 COOH PhenylalanineFPhe-CH 2 C 6 H 5 GlycineGGly-H HistidineHHis-CH 2 (4-imidazoyl) IsoleucineIIle-CH(CH 3 )CH 2 CH 3 LysineKLys-(CH 2 ) 4 NH 2 LeucineLLeu-CH 2 CH(CH 3 ) 2 MethionineMMet-(CH 2 ) 2 SCH 3 AsparagineNAsn-CH 2 CONH 2 ProlinePPro-CH 2 CH 2 CH 2 - GlutamineQGln-(CH 2 ) 2 CONH 2 ArginineRArg-(CH 2 ) 3 NH-C(=NH)NH 2 SerineSSer-CH 2 OH ThreonineTThr-CH(CH 3 )OH TryptophanWTrp-CH 2 (3-indolyl) TyrosineYTyr-CH 2 -(C 6 H 4 OH) ValineVVal-CH(CH 3 ) 2 Proline

63 © 2012 Biotage 63 Formacion de un enlace peptico

64 © 2012 Biotage 64 Secuencia en Sintesis de Peptidos en Fase Solida (SPPS)

65 © 2012 Biotage 65 Desde la perpectiva de procedimiento instrumental » Secuencia pre-establecida de pasos que se debe efectuar cuidando una alta precision en los parametros operacionales: tiempo, temperatura, y dispensacion de reactivos –Proteccion –Deproteccion –Acoplamiento –Lavado R + P + K + P + Q + Q + F + F + G + L + M + A

66 © 2012 Biotage 66 Sintesis de Peptidos asistida con horno de microondas » En la síntesis de péptidos, la radiación de microondas se ha usado para la completar secuencias peptídicas de gran longitud con rendimientos muy elevados y pocos efectos de conversion negativa (racemización) » El acoplamiento de los aminoácidos a la cadena peptídica no se cataliza sólo mediante el aumento de la temperatura sino también debido a la radiación electromagnética alterna con la cual se alinea continuamente el esqueleto polar del polipéptido. » A causa de este fenómeno, la energía microondas puede evitar la agregación y por tanto incrementar el rendimiento final del péptido. » En algunos procesos de sintesis de peptidos, el calentamiento por encima de los grados celsius evita también la agregación y acelera el acoplamiento. » Las unicas limitaciones detectadas en el uso de microondas, es la racemización que puede producirse durante el acoplamiento de la cisteína y la histidina. La reacción de acoplamiento de estos aminoácidos se realiza a temperaturas más bajas que los otros 18 aminoácidos naturales » Uno de los efectos no deseados más importantes es la deshidratación (pérdida de agua) que puede ser muy elevada en ciertos péptidos, como el polipéptido pancreático (PP), efecto secundario que puede también observarse con el simple calentamiento tradicional.

67 © 2012 Biotage 67 Soluciones en Sistemas de Sintesis de Peptidos a traves de Biotage MW RT

68 © 2012 Biotage 68 Clasificacion operativa » Manual –Requiere intervencion del usuario en la ejecucion de todos los pasos requeridos para procesar la sintesis de peptidos Estacion de Trabajo para Petidos con Initiator+ » Semi-automatico –Solo algunos de los pasos del proceso son efectuados por el equipo (deproteccion Fmoc, y lavado), requiriendo menos intervencion del en el proceso general de sintesis SAP, SAM » Automatico Todos la secuencia de sintesis es realizada por el equipo, requiriendo minima intervencion del usuario, una vez iniciada la corrida de la secuencia de sintesis Syro I, Syro 2, Syro Wave, Alstra, SP Wave

69 © 2012 Biotage 69 Temperatura Ambiente: Biotage SAP & SAM (semi-automaticos) SAP esta diseñado para sintesis de un (1) peptido a la vez SAM diseñado para sintesis simultanea de varios peptidos

70 © 2012 Biotage 70 Temperatura Ambiente: Biotage Syro I Sistema automatizado para Sintesis de Peptidos Paralela Sistema de un (1) brazo robotico, equipado con 2 bombas de jeringa digitales Para laboratorios con alto volumen de produccion de peptidos (>50 por mes) Poderoso software de programacion y control de la secuencia de sintesis

71 © 2012 Biotage 71 Temperatura Ambiente: Biotage Syro II Sistema automatizado para Sintesis de Peptidos Paralela Escala de sintesis variable desde 1 a 300umol Sistema de un (2) brazo robotico, equipado con 4 bombas de jeringa digitales Para laboratorios con alto volumen de produccion de peptidos (>50 por mes) Poderoso software de programacion y control de la secuencia de sintesis

72 © 2012 Biotage 72 Asistido con Microondas: Biotage Syro Wave Sistema de sintesis de Peptido Paralela de alto volumen de produccion asistido con horno de microondas.

73 © 2012 Biotage 73 Biotage Syro Wave Sintesis paralela de alto volumen automatizada: alta productividad y eficiencia en costo Disponibilidad de microondas para mejorar eacciones dificiles y reducir tiempo de sintesis de peptidos complejos

74 © 2012 Biotage 74 Biotage Initiaror+ ALSTRA Asistido con horno de Microondas: Initiator+ Alstra

75 © 2012 Biotage 75 Sintesis asistida con microondas Totalmente automatizado Tubos de reaccion desechables Para sintesis en escala de 5 µmol - 2 mmol Unidad de control y software de operacion integrado Metodos de sintesis pre-definidos ya disponibles en base de datos de aplicaciones, asi como protocolos abiertos para desarrollo por usuario Agitacion por oscilacion, para mayor eficiencia de acoplamiento Bombas de jeringa digitales Compacto Initiator+ ALSTRA Especificaciones

76 © 2012 Biotage 76 Asistido con microondas: Initiator + SP Wave Solucion versatil para sintesis organica y de peptidos Poderosa herramienta de desarrollo para sisntesis de peptidos y petodomimeticos, incluyendo modificaciones complejas, en procedimientos sencillos o de multiples pasos Ideal para sintesis de baja scala (1-10 peptidos por mes, cadenas de menos de 20 aminoacidos por peptido) Operacion semi-automatica reduce el consumo y desecho de reactivos (muchos de alto costo)

77 © 2012 Biotage 77 Resumiendo…. » La sintesis de peptidos en fase solida (SPPS) es una tecnica poderosa para acelerar la sintesis de peptidos y peptomimeticos » La utilizacion de radiaccion de microondas contribuye a una reducir el tiempo de sintesis, e incrementa la pureza de las reacciones » Calentamiento con microondas mejora la eficiencia de acoplamiento y previene reacciones indirectas. » Reduce el costo de sintesis al facilitar el uso de reactivos de acoplamiento estandar » Mayor potencial para Quimica Verde a traves del uso de solventes menos agresivos

78 © 2012 Biotage 78 Productos complementarios para Sintesis de Peptidos tambien disponibles a traves de Biotage » Resinas de acoplamiento ChemMatriz –100% polietilenglicol –Compatibles con radiacion de microondas » Columnas de purificacion de peptidos sinteticos RESOLUX –Columnas analiticas, semi- prearativas y preparativas –Capacidad para separar peptidos que difieran en tan solo un aminoacido

79 © 2012 Biotage 79 Questions?


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